كلونينگ و بررسي بيان ژن flaA هليكوباكتر پيلوري در سيستم يوكاريوتي

Cloning and Study of Expression of Helicobacter Pylori FlaAGene in Eukaryotic System

زمينه: هليكوباكتر پيلوري شايع‌ترين باكتري است كه جوامع انساني را در ابعاد جهاني مبتلا به عفونت ساخته است. بيان فلاژل و تحرك باكتري در كلونيزاسيون و ويرولانس آن عامل بسيار مهمي است. ژن flaA يكي از ژن‌هاي كد كننده فلاژلين مي‌باشد كه نقش كليدي در حركت باكتري و كلونيزاسيون آن دارد و از نظر ايمني بخشي نيز مورد توجه مي‌باشد. هدف از اين مطالعه طراحي، ساخت سازواره و بررسي بيان ژن flaA هليكوباكتر پيلوري در سلول‌هاي يوكاريوتي است. موادوروش‌ها: در اين مطالعه تجربي، ابتدا از هليكوباكتر پيلوري سويه استاندارد، DNA ژنومي تخليص و ژن flaA با پرايمرهاي اختصاصي به روش PCR تكثير و جداسازي شد. سپس با بهره‌گيري از تكنيك همسانه سازي T/A در پلاسميد pTZ كلون گرديد. به منظور بيان ژن flaA و ايجاد سازواره نهايي، ژن flaA از پلاسميد pTZ خارج شد و در وكتور بياني (-)pcDNA3.1 ساب كلون گرديد. سازواره -flaA(-)pcDNA3.1 به روش الكتروپوريشن به سلول جانوري CHO منتقل و بيان يوكاريوتي ژن flaA با تكنيك SDS-PAGE بررسي شد. يافته‌ها: نتايج نشان مي‌دهد محصول PCR ژن flaA در وكتور pTZ كلون و در باكتري اشريشيا كلاي سويه TOP10F تكثير يافته است. همچنين هضم آنزيمي و تعيين توالي حاكي از تشكيل سازواره نهايي -flaA(-)pcDNA3.1 است. در نهايت بررسي بيان ژن flaA هليكوباكتر پيلوري در سلول جانوري CHO، نشان داد سازواره ژني حاصل قادر به بيان موفق محصول ژن flaA در سيستم يوكاريوتي مي‌باشد. نتيجه‌گيري: با توجه به اينكه سازواره نهايي -flaA(-)pcDNA3.1 قادر به بيان محصول پروتئيني ژن flaA هليكوباكتر پيلوري در سلول‌هاي جانوري مي‌باشد و پروتئين فلاژلين يكي از آنتي ژن‌هاي مهم اين باكتري است. بنابراين به درستي مي‌توان گفت كه سازواره ژني -flaA(-)pcDNA3.1 كانديداي مناسبي براي استفاده در زمينه واكسن‌هاي ژني عليه هليكوباكتر پيلوري مي‌باشد و در تحقيقات آينده مي‌توان از آن براي بررسي ايمني زايي در حيوانات آزمايشگاهي بهره گرفت.

Background: Helicobacter pylori is the most common bacterium causing chronic infections worldwide. Expression of flagella and bacterial motility are essential in colonization and virulence. FlaA gene is one of the flagellin-encoding genes that play the key role in the colonization and bacterial motility, and it has a significant impact on immunization. This study aimed to design, construct and evaluate the Helicobacter pylori flaA gene expression in eukaryotic cells. Material and Methods: In this experimental study, genomic DNA was purified from the Helicobacter pylori standard strain, and flaA gene was amplified and isolated by PCR method with using the specific primers. Then, this gene was cloned into pTZ vector by T/A cloning technique. To express flaA gene and generate the final construct, the flaA gene was removed from pTZ plasmid and subcloned into the pcDNA3.1 (-) expression vector. The pcDNA3.1 (-)-flaA construct was transformed into CHO cells by electroporation, and flaA eukaryotic gene expression was studied using the SDS-PAGE method. Results: The results showed that flaA gene PCR product was cloned into pTZ vector and amplified in Escherichia coli TOP10F strain. Also, the enzymatic digestion and sequencing showed that the pcDNA3.1 (-)-flaA was performed. Finally, the evaluation of the Helicobacter pyloriflaA gene expression in CHO cells showed that the generated gene construct could express the flaA product in a eukaryotic system, successfully. Conclusion: Given that the pcDNA3.1 (-)-flaA as a final construct can express the flaA protein of the Helicobacter pylori in animal cells. Flagellin protein is one of the essential antigens of the bacterium So we can appropriately say that gene pcDNA3.1(-)-flaA construct is a suitable candidate for usage in the field of gene vaccines against Helicobacter pylori and it can be used to check the immunization in the laboratory animals in the future research.