بررسي بيان ژن lnT هليكوباكتر پيلوري در سلول‌هاي HDF انسان به روش RT-PCR

Survey of Helicobacter Pylori lnT Gene Expression in HDF Cells by RTPCR Method

زمينه و هدف: هليكوباكتر پيلوري، باكتري مارپيچي شكل و گرم منفي است كه موجب بيماري­هاي معده و دوازدهه در انسان مي­شود. به دليل وجود ايراداتي در درمان­هاي آنتي­بيوتيكي، تلاش­هاي رو به افزايشي در جهت توليد واكسن مؤثر براي اين عفونت صورت گرفته است. هدف از اين تحقيق، ساخت سازواره­ ژني حامل قطعه ژن lnT و بررسي بيان آن در سلول­هاي انساني به روش RT-PCR است. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه آزمايشگاهي، ژن lnT از ژنوم هليكوباكتر پيلوري به روش واكنش زنجيره­اي پليمراز (Polymerase Chain Reaction) جدا شد. همسانه‌سازي محصولات PCR به روش كلون‌سازي T/A در وكتور T مناسب، انجام شد. سپس ژن lnT در وكتور بياني يوكاريوتي pEGFP-C2 ساب­كلون گرديد. جهت بررسي بيان ژن lnT، سازواره pEGFP-C2-lnT به روش الكتروپوريشن به سلول­هاي فيبروبلاست پوست انسان منتقل و بيان آن به روش RT-PCR بررسي شد. يافته­ها: انجام PCR منجر به تكثير قطعه 1290 جفت بازي مربوط به ژن lnT گرديد. اين ژن با موفقيت در وكتور pTZ همسانه‌سازي شد و نتايج هضم آنزيمي و تعيين توالي نشان داد ژن lnT در وكتور بياني ساب­كلون گرديده و سازواره نهايي pEGFP-C2-lnT ايجاد شده است. بررسي بيان اين ژن به روش RT-PCR، تشكيل باند اختصاصي اين ژن را نشان داد. نتيجه­ گيري: ژن lnT همسانه‌ سازي شده در وكتور بياني يوكاريوتي pEGFP-C2، توان توليد محصول اختصاصي اين ژن در سلول ­هاي يوكاريوتي را دارد. لذا به ­نظر مي‌رسد اين سازواره ژني، از پتانسيل لازم براي بررسي ايمني­زايي در مدل حيواني به عنوان واكسن ژني عليه هليكوباكتر پيلوري برخوردار باشد.

Helicobacter pylori is a gram-negative and spiral bacterium that causes stomach and duodenal disease in humans. Because of the presence of disadvantages in antibiotic therapies, increasing efforts have been made to produce effective vaccine for this infection. The aim of this study was to generate a construct carrying the lnT gene and to survey its expression in human cells with RT-PCR method. Materials and Methods: In this laboratory study, lnT gene from the genome of Helicobacter pylori bacterial was isolated via polymerase chain reaction (PCR). Cloning of the PCR products was done by T/A cloning method in the appropriate T vector. Then, the lnT gene was subcloned into a pEGFP-C2 eukaryotic expression vector. To study the lnT gene expression, the final pEGFP-C2-lnT construct was transformed into human dermal fibroblasts (HDF) cells by electroporation and its expression was analyzed by RT-PCR. Results: The performance of the PCR resulted in amplification of 1290 bp segment as to lnT gene. This gene was successfully cloned in pTZ vector and enzyme digestion and sequencing results showed lnT gene was subcloned in the expression vector and final construction of the pEGFP-C2-lnT was created. Gene expression analysis by RT-PCR showed the relevant band. Conclusion: Based on the obtained results, lnT gene cloned in the pEGFP-C2 eukaryotic expression vector has the ability to produce the specific product of this gene in eukaryotic cells. Therefore, this gene construction has the required potential to evaluate the immunogenicity in an animal model as a gene vaccine against Helicobacter pylori.