شناسايي چند شكلي در ناحيه تنظيمي بالادست ژن هاي كالپاين و كالپاستاتين و ارتباط آن با برخي صفات اقتصادي در گوسفندان لري بختياري

Detection of polymorphism in upstream regulatory region of calpain and calpastatin genes and its association with body weight and fat-tail characteristics traits in Lori-Bakhtiari sheep

سابقه و هدف: هدف از پژوهش حاضر بررسي تنوع آللي در ناحيه تنظيمي بالا دست ژن‌هاي كالپاين و كالپاستاتين، تجزيه و تحليل بيوانفورماتيك ژن‌هاي مورد نظر و ارتباط آماري واريانت‌هاي آللي با صفات وزن‌ بدن و دنبه در گوسفند لري بختياري بوده است. مواد و روش ها: تعداد 150 نمونه خون به طور تصادفي تهيه و DNA با روش نمكي بهينه يافته استخراج شد. سپس جفت آغازگرهاي اختصاصي با نرم افزارOligo7 به ترتيب براي تكثير قطعاتي با اندازه‌هاي 245 و 225 جفت بازي از ناحيه بالا دست ژن‌هاي كالپاستاتين و كالپاين طراحي شدند. پس از انجام PCR فرآورده هاي تكثيري حاصل از جايگاه هاي نشانگري كالپاستاتين و كالپاين به ترتيب در معرض هضم با آنزيم‌هاي اندونوكلئاز PstI و HaeIII قرار گرفتند. به دليل يك شكل بودن نتايج حاصل RFLP، براي ارزيابي دقيق تر توالي‌هاي تكثير شده از تكنيك SSCP استفاده شد. بعد از تعيين ژنوتيپ، از هر الگوي باندي ژن كالپاين يك نمونه مورد توالي يابي قرار گرفت. براي شناسايي موتيف‌هاي درگير در فرآيند تنظيم ژني و همچنين جهش هاي موجود در الگوهاي باندي مختلف، توالي‌هاي به دست آمده با استفاده از نرم افزارهاي DNASIS MAX و BioEdit مورد بررسي قرار گرفتند. ارتباط الگوهاي باندي مشاهده شده در جايگاه كالپاين با صفات وزن‌ بدن در تولد، 3، 6 و 12 ماهگي و صفات دنبه شامل وزن، محيط بالا و پايين و ارتفاع دنبه در گوسفند لري بختياري با استفاده از رويه Glimmix نرمافزار SAS (نسخه 9/1) مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها: سه الگوي باندي مختلف A، B و C در جايگاه كالپاين در نمونه هاي لري بختياري به ترتيب با فراواني هاي 66، 9 و 25 در صد مشاهده شدند. ناحيه بالادست جايگاه ژني كالپاستاتين در پژوهش حاضر يك شكل بود. تجزيه و تحليل آماري وجود ارتباط آماري معني داري را بين الگوهاي باندي در جايگاه نشانگر كالپاين و صفت وزن تولد در گوسفندان لري بختياري نشان داد (P<0.05) همچنين هم ترازي توالي هاي الگوهاي باندي مشاهده شده براي جايگاه نشانگر كالپاين در گوسفندان مورد مطالعه وجود شش چند شكلي تك نوكلئوتيدي را در موقعيتهاي مختلف نشان داد. نتيجه توالي يابي ژن كالپاستاتين رفتار يك شكل بودن الگوهاي باندي اين ژن را تاييد كرد، به طوري كه تفاوتي بين توالي هاي بدست آمده براي اين ژن مشاهده نشد. آناليز مقايسه اي موتيفها بين توالي هاي مورد مطالعه نشان داد كه تمامي موتيفها بين الگوهاي باندي مشترك بودند به جز موتيف هاي yeast_terminationCS و 1 PEA3_CS كه در الگوي باندي C وجود نداشته و موتيف alpha_INF.2 كه فقط در الگوي باندي C وجود داشت. نتيجه گيري: با توجه به چند شكل بودن ناحيه تنظيمي بالادست جايگاه كالپاين و معني دار بودن ارتباط آن با صفت وزن تولد، احتمالاً بتوان از اين جايگاه نشانگري در برنامه هاي اصلاح نژادي براي بهبود كيفيت گوشت در گوسفند بهره برد.

Background and objective: The aim of the present study was to investigate allelic diversity in the upstream regulatory region of calpastatin and calpain genes, bioinformatics analysis of studied genes and association of allelic variants with body weight and fat-tail traits in Lori-Bakhtiari sheep. Materials and methods: One hundred and fifty blood samples were collected randomly and DNA was extracted by modified salting out method. The specific primer pairs were designed using Oligo7 software for amplification of fragments with lengths of 245 and 225 bp from the upstream regulatory region of calpastatin and calpain genes, respectively. After PCR, the amplified products of calpastatin and calpain marker sites were subjected to endonuclease digestion with PstI and HaeIII enzymes, respectively. Due to the monomorphic of RFLP results, the SSCP technique was used for more accurate assessment of amplified fragments. After genotyping, one sample from each banding patterns of calpain gene was sequenced. The obtained sequences were investigated for identification of motifs involved in gene regulation and also mutations in different banding patterns by DNASIS MAX and BioEdit software. Association between observed banding patterns and body weight traits at birth, 3, 6, and 12 months of age and weight, upper bound, lower bound, and the height of fat-tail was investigated by Glimmix procedure of SAS (version 9.1) software. Results: Three banding patterns of A, B, and C with frequencies of 66, 9, and 25% were observed in Lori-Bakhtiari samples, respectively. The upstream region of calpastatine gene was monomorph in present study. Statistical analysis showed significant association between banding patterns of calpain marker site and body weight at birth in Lori-Bakhtiari sheep (P<0.05). Also, sequences alignment of observed banding patterns for calpain gene in studied sheep showed six single nucleotide polymorphisms in different positions. Result of calpastatin gene sequencing confirmed its monomorphic behavior so that no differences were observed between the sequences of this gene. Comparative motifs analysis between studied sequences showed that all motifs were common between the banding patterns except PEA3_CS and yeast_terminationCS1 which were not observed C banding pattern and alpha_INF.2 which observed only in C banding pattern. Conclusion: According to the polymorphic pattern in upstream regulatory region of calpain locus and its significant association with birth weight, this marker site may be used in breeding programs to improve meat quality in sheep.