ساخت وكتور بياني pcDNA3.1-FSHβ به منظور انتقال ژن زير‌واحد FSHβ به سلول لاين پستان‌داران

Construction of pcDNA3.1-FSHβ expression vector in order to transfer FSHβ gene into a mammalian cellline

سابقه و هدف: هورمون محرك فوليكولي (Follicle stimulating hormone, FSH)، يكي از هورمون‌هاي گليكوپروتئيني هيپوفيز است كه از دو زير‌واحد آلفا و بتا تشكيل شده است. زيرواحد بتا حاوي 111 اسيدآمينه و يك سيگنال پپتيد 18 اسيدآمينه‌اي و مسئول فعاليت بيولوژيكي هورمون مي‌باشد. هدف از اين مطالعه ساخت وكتور بياني pcDNA3.1-FSHβ به منظور انتقال ژن زير‌واحد FSHβ به سلول لاين پستانداران بود. مواد و روش‌ها: ابتدا يك جفت پرايمر براي ساب‌كلونينگ زنجيره β از T.vector طراحي گرديد تا علاوه بر داشتن نواحي ابتدا و انتهاي ژن زنجيره β داراي محل اثر آنزيم‌هاي HindΙΙΙ و EcoRΙ باشد. زنجيره بتاي آمپليفيه شده از ناحيه جاي‌گاه دو آنزيم فوق در پلاسميد pcDNA3.1 كلون و پلاسميد نوتركيب به وسيله ترانسفورماسيون وارد سلول E.coli گرديد. كلون‌هاي تشكيل‌شده به وسيله PCR مجدد بررسي و پلاسميد تعدادي از كلون‌هاي مثبت تخليص گرديد. صحت پلاسميدهاي خالص شده به دو روش هضم آنزيمي و تعيين توالي تأييد گرديد. يافته‌ها: آناليز آنزيمي و تعيين توالي نشان داد كه پلاسميد pcDNA3.1-F390β داراي ساختار پلاسميدي و توالي ژني صحيح است و تطابق كامل با ژن بتاي هورمون FSH گزارش شده در GenBank دارد. نتيجه‌گيري: اين پلاسميد نوتركيب به لحاظ ساختاري صحيح و جهت انتقال ژن به سلول كشت پستان‌داران و ارزيابي بيان مناسب مي‌باشد.

Introduction: Follicle stimulating hormone (FSH) is one of the glycoprotein hormones of pituitary gland that consists of two subunits, alpha and beta. Beta subunit has 111 amino acids and a signal peptide, which is consisted of 18 amino acids and it is responsible for biological activity of the hormone. The aim of this study was to construct a pcDNA3.1FSHβ expression vector in order to transfer FSHβ gene into a mammalian cell line. Materials and Methods: To sub-cloning of beta chain from T.vector, a pair of primer was designed that they had a site for EcoRI and HindIII in addition of the start and stop site of the beta chain gene. Amplified beta chain was cloned in pcDNA3.1 at the site of the mentioned enzymes anvd the recombinant plasmid was transformed into E.coli cell. The resulting colonies were checked by PCR re-amplification. The plasmid was purified from some positive colonies. The accuracy of purified plasmids were confirmed by both enzyme digestion and sequencing. Results: Enzyme analysis and sequencing demonstrated that pcDNA3.1-F390β had both correct construction and gene sequence which had an exact correlation with reported FSHβ gene in GenBank. Conclusion: This recombinant plasmid structurally is correct and is proper for transmitting into mammalian cell culture.