بررسي ايمني‌زايي آنتي‌ژن‌هاي STxB و STxB-IpaD به‌صورت نازال در رت‌هاي آزمايشگاهي

Nasal immunogenicity induced by STxB and STxB-IpaD antigens in laboratory rats

سابقه و هدف: باكتري‌هاي شيگلا و ايشرشيا‌كلي شايع‌ترين عامل اسهال است و واكسن موثري عليه آن‌ها توليد نشده است. پروتئين IpaD نقش مهمي در تهاجم، بيماري‌زايي و ايجاد عفونت توسط شيگلاها دارد. يكي ديگر از فاكتورهاي بيماري‌زاي اصلي در شيگلا ديسانتري تيپ 1 و E. coli O157:H7 انتروتوكسين شيگلا يا (STxB) مي‌باشد. با ممزوج پروتئين IpaD با STxB مي‌توان كانديداي واكسن مناسب تهيه نمود. در اين مطالعه تيتر آنتي‌بادي پروتئين‌هاي نوتركيب STxB-IpaD ممزوجي و STxB نازالي و ايمني‌زايي آن‌ها در رت با يك‌ديگر مقايسه شده است. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي، وكتورهاي (pET28-stxB) ,(pET28-ipaD-stxB) از مركز زيست‌شناسي دانشگاه امام حسين(ع) تهيه گرديد. با ترانسفورم اين وكتورها به درون باكتريcoli BL21 DE3.E، به‌وسيله PCR و برش آنزيمي تاييد شدند. پروتئين‌هاي نوتركيب توليد شده به وسيله SDS-PAGE و لكه‌گذاري وسترن مورد تاييد قرار گرفتند. بيان ژن‌هاي STxB-IpaD ممزوجي و STxB تحت القاي IPTG انجام و بعد از تخليص پروتئين با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي، آنتي‌ژن‌هاي حاصل در چهار نوبت متوالي به‌صورت نازال به رت‌ها در گروه پنج تايي تجويز شدند. آنتي‌بادي پلي‌كلونال توليد شده در سرم رت‌ها اندازه‌گيري گرديد. يافته‌ها: نتايج الايزا نشان داد كه آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن‌ STxB در رت‌ها توليد شده و با ممزوج شدن IpaD به STxB ميزان تيتر آنتي‌بادي نسبت به تيتر آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن‌ STxB افزايش يافته است. رت‌هاي ايمن‌شده با آنتي‌ژن‌ STxB توانستند تا 6 برابر LD50 و رت‌هاي ايمن‌شده با آنتي‌ژن STxB-IpaD تا 10 برابر LD50 شيگا توكسين E. coli O157:H7 را تحمل نمايند. نتيجه‌گيري: پروتئين حاصل از امتزاج ژن‌هاي IpaD و STxB، مي‌تواند اثر ايمني‌زايي آنتي‌ژن STxB را افزايش دهد. پروتئين‌هاي ممزوجي با پروتئين نوتركيب STxB را به‌صورت نازالي و بدون ادجوانت شيميايي به‌عنوان كانديد مناسب براي توليد واكسن نوتركيب عليه انواع شيگلا و ايشرشيا‌كلي مي‌توان توصيه نمود.

Introduction: Shigella and E. coli bacteria are the most common cause of Diarrhea, though as yet no effective vaccine against them has been produced. IpaD protein plays an important role in invasion and infection caused by Shigella. Another major virulence factor in Shigella dysenteriae type 1 and E. coli O157: H7 is Shigella enterotoxin or (STxB). IpaD protein in combination with STxB can produce a suitable candidate vaccine. In this study, the nasal STxB and STxB-IpaD fused recombinant proteins antibody titers and their immunogenicity were assessed and compared in rats. Materials and Methods: (pET28- stxB) and (pET28-ipaD-stxB) vectors were prepared at Biology center of the Imam Hussein University (AS). Transformation of these plasmids into E. coli BL21 DE3 bacteria were confirmed by PCR and enzymatic digestion. Production of recombinant proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Expression of fused STxB-IpaD and STxB antigens were performed under induction of IPTG. After protein purifications, using affinity chromatography, antigens were prescribed nasally to five groups of rats in four consecutive sessions. Later the polyclonal antibodies produced in rat sera were measured. Results: ELISA showed that antibody titers were increased by the combination of IpaD to STxB compared to that produced against single STxB antigen. The immunized Rats with StxB antigen were able to tolerate up to six fold of LD50, while rats that were immunized with STxB-IpaD combined antigens were able tolerate up to tenfold of LD50 for E. coli O157: H7 Shiga toxin. Conclusion: The protein produced from the fusion of ipaD and stxB genes, can increase the effect of single STxB antigen immunogenicity. Recombinant proteins fused with STxB protein without chemicals adjuvants can be recommended in the form of nasal drops as possible candidates for vaccines against E. coli and Shigella types.