بررسي كارايي ژن هاي تنظيم كننده مسيرهاي ترجمه و پس از ترجمه در بهينه سازي بيان فاكتور فعال كننده پلاسمينوژن بافتي

Efficiency of translation and post-translation regulatory genes in optimization of tissue plasminogen activator gene expression

سابقه و هدف: سلولهاي تخمدان همستر چيني (CHO)پركاربردترين سيستم ميزباني براي بيان پروتئينهاي نوتركيب ميباشند. روشهاي متنوعي هم‌چون ايجاد وكتورهاي بياني بهينه و نيز ميزبانهاي مهندسي شده براي افزايش ميزان بيان پروتئين در اين ميزبان بهكار گرفته شدهاند. در اين مطالعه روش مهندسي سلول بر پايه ژنهاي موتان غير قابل فسفريله شونده زير‌واحد آلفاي فاكتور آغازي يوكاريوتي 2 (eIF2α S51A) و پروتئين انتقال‌دهنده سراميد (CERT S132A)، كه به ترتيب مسيرهاي ترجمه و ترشح پروتئين را در سلول كنترل ميكنند، به منظور ايجاد رده سلولي CHO بهينه بهكار گرفته شده است. مواد و روش‌ها: هر يك از ژنهاي CERT S132A، eIF2α S51A و فاكتور فعال‌كننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA) در وكتور بياني مناسب كلون شدند. جمعيتهاي سلولي پايدار بيانكننده هر يك از ژنهايCERT S132A و eIF2α S51A ايجاد شده و كارايي اين سلولها در بيان موقتي ژن t-PA در مقايسه با سلولهاي دستورزي نشده مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: وارد شدن هر يك از ژنهاي CERT S132A و eIF2α S51A در ژنوم سلول ميزبان از طريق انجام PCR بر DNA ژنومي سلولهاي پايدار تائيد شد. هم‌چنين در وسترن‌بلات باند اختصاصي مطابق با هر يك از پروتئينهاي CERT S132A و eIF2αS51A مشاهده شد. بيان ژن CERT S132A افزايش بيان 50% را در بيان t-PA بهدنبال داشت. در مقابل در سلولهاي پايدار شده با ژن eIF2α S51A تاثير مثبتي بر ميزان بيان مشاهده نشد. نتيجه‌گيري: نتايج اين تحقيق كارايي روش مهندسي سلول بر پايه ژن CERT S132A را در ايجاد سلول CHO بهينهشده نشان ميدهد.

Introduction: Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most commonly used host system for the expression of high quality recombinant proteins. Different strategies such as generation of more efficient expression vectors and establishment of genetically engineered host cells have been employed to improve recombinant protein expression in this system. Here the cell line engineering strategy based on the phosphorylation resistant variants of eukaryotic initiation factor 2 alpha(eIF2α) and ceramide transfer protein(CERT), key mediators of protein translation and secretion, have been used to develop improved CHO host cells. Materials and Methods: The CERT S132A, peIF2α S51A and tissue plasminogen activator (t-PA) were cloned in suitable expression vectors. CERT S132A and peIF2α S51A stable cell pools were generated and the efficacy of the cells for transient expression of t-PA was evaluated in comparison to un-modified CHO cells. Results: Integration of CERT S132A and peIF2α S51A expression vectors in CHO cell genome confirmed by PCR analysis of genomic DNA from stable cells. Moreover, the specific bands for CERT S132A and peIF2α S51A proteins were observed in Western blot analysis. Expression of CERT S132A gene increased expression of t-PA by 50%. However no positive effect on t-PA expression was observed in the peIF2α S51A stable cell pools. Conclusion: This study showed the efficiency of CERT S132Abased cell line engineering approach for the development of optimized CHO host cells.