بررسي اثرات دور و زمان هاي سانتريفيوژ و زمان فريز كردن بر مقدار ميكروپارتيكل توليدشده از فرآورده كنسانتره پلاكتي

Effects of speed and time of centrifugation and time of freezing on the amount of produced microparticles from concentrates platelet

سابقه و هدف: روش اصلي جداسازي ميكروپارتيكل‌هاي پلاكتي(PMP) بر اساس دور سانتريفيوژ و زمان مي‌باشد. با توجه به هزينه ‌بالاي تعيين تعداد PMP از طريق ميكرو‌ذرات (micro-bead) و هم‌چنين ضرورت استفاده از دستگاهي پرهزينه مانند فلوسايتومتر، به نظر مي‌رسد تعيين غلظت PMP به روش برادفورد روشي ارزان، سريع و به‌صرفه مي‌باشد. بنابراين در اين مطالعه تاثير فاكتورهاي دور و زمان‌هاي مختلف سانتريفيوژ و زمان فريز كردن بر غلظت ميكروپارتيكل‌هاي كيسه‌هاي پلاكتي كنسانتره بررسي شد. مواد و روش‌ها: دو دور متفاوت سانتريفيوژ براي جداسازي ميكروپارتيكل‌ها بررسي شد. براي تهيه پلاسماي غني از پلاكت، در پروتكل اول، كيسه پلاكتي در g 1500 به مدت 15min و در پروتكل دوم، در g 5000 با همان زمان سانتريفيوژ گرديد. براي بررسي اثر زمان، جداسازي ميكروپارتيكل‌ها در g 16000 به مدت 20 min و 2 min انجام گرديد. به منظور بررسي غلظت PMP از روش برادفورد استفاده شد. براي بررسي اثر فريز شدن بعد از تهيه PRP در g300 به مدت 20 min، لوله‌ها در c˚80- فريز شدند. تعيين هويت ميكروپارتيكل‌ها توسط آناليز فلوسيتومتري انجام شد. يافته‌ها: غلظت PMP در پلاسماي غني از پلاكت حاصل از دور سانتريفيوژ g 1500 غلظت بالاتري را نشان داد (05/0p value≤). غلظتPMP بين زمان‌هاي2 min و 20 min سانتريفيوژ تفاوت معناداري نشان نداد (05/0p value≥). در بررسي اثر فريز شدن نشان داده شد كه توليد PMP نسبت به روز اول در تمام روزها افزايش معني‌دار يافته بود. ميكروپارتيكل‌ها داراي ماركر CD41 بودند كه بيانگر منشا پلاكتي آن‌هاست. نتيجه‌گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد كه كاهش دور سانتريفيوژ منجر به توليد مقادير بيش‌تري ميكروپارتيكل مي‌گردد. ولي افزايش زمان جداسازي در مرحله دوم اثر معناداري بر مقدار PMP جداشده نداشت. هم‌چنين با استفاده از فريز مي‌توان به مقادير بيش‌تري PMP دست يافت

Introduction: The main method of separating platelet microparticles (PMP) is based on the centrifugation speed and time. Due to the high cost of determining the number of PMP via micro-particles (micro bead) and also the necessity of using an expensive device such as a flow cytometer, it seems that Bradford method would be rather an inexpensive, fast and efficient way to determine the concentration of PMP. Therefore, in this study the effect of different factors, such as speed and time of centrifugation and time of freezing on the concentration of PMP in the platelet concentrates bags was studied. Materials and Methods: We studied two different speeds of centrifugation for separating PRP. In the first protocol for preparation of PRP, the platelet bags were centrifuged at 1500g for 15min and in the second protocol; they were centrifuged at 5000g for the same duration. To evaluate the effect of time, microparticles were separated in 16000g for 20 and 2 min. To determine the concentration of PMP, Bradford method was used. To evaluation the effect of freezing, the PRP was prepared at 300g for 20 min, and then it was freezed in -80˚c for five days. Flow cytometery analysis was performed for microparticles identification. Results: PMP concentrates with the 1500g centrifugation speed showed higher concentration (P <0.05). There was not any significant difference in concentrations of PMPs in relation to the time of centrifugation (2 and 20 min) (P <0.05). Freezing the platelet bags led to higher PMP concentration in compare to the first day of experiment. Flow cytometry analysis showed that microparticles had platelet marker CD41, which represented their origin. Conclusion: The result of this study showed that the reduction of centrifugation speed could produce higher levels of the microparticles. In addition, the time of separation in the final stage had no significant effect on PMP isolation. Freezing could lead to higher PMP concentration.