كلونينگ و بيان ژن رمزگذار آنزيم تجزيه‌كننده تركيبات آلي فسفره (opd) در باكتري Escherichia coli

Cloning and studing the function of opd gene encoding organophosphorus hydrolase in Escherichia coli

كاربرد گستردۀ تركيب‌هاي آلي فسفرۀ منجر به بروز اثر زيان‌آور زيست‌محيطي بسياري شده است. استفاده از ميكروارگانيسم­ها در پالايش و اندازه‌گيري اين تركيب‌هاي ناگوار به‌عنوان يك رويكرد دوستدار محيط­زيست و مناسب شناخته شده است. آنزيم ارگانوفسفروس هيدرولاز از آنزيم‌هاي هيدروليزكنندۀ فسفوتري­استري است كه در برخي ميكروارگانيسم­ هاي خاك به‌ويژه Flavobacterium sp.شناسايي شده و قادر به هيدروليز تعدادي از تركيب‌هاي فسفرۀ آلي است. در اين پژوهش بهينه‌سازي كدون‌هاي توالي رمزگذار اين پروتئين براي بيان در باكتري Escherichia coli انجام شد و سپس همراه با پروموتر lac، در وكتور پروموتر-پروب pTH1705 به‌صورت ادغام الگوبرداري كلون شد و ترانسفورماسيون‌ در دو سويۀ‌ باكتري E. coli انجام گرفت. محيط كشت معدني M9 حاوي غلظت 10و 50 ميلي­گرم در ليتر ديازينون، براي سنجش عملكرد باكتري تراريخت بيان‌كنندۀ ژن opd (به‌صورت in trans) استفاده شد. بررسي منحني رشد استرين E. coli V103 نشان داد، رشد باكتري در غلظت 50 ميلي­گرم در ليتر ديازينون تا حد زيادي تحت تأثير (وجود آفت­كش) قرار مي­گيرد درحالي‌كه در غلظت 10 ميلي‌گرم در ليتر ديازينون اين تأثير كمتر است. نتايج حاصل از كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا به‌عنوان يك روش استاندارد نشان داد، غلظت ديازينون در محيط كشت باكتري، در چهار استرين V100، V101، V102 و V103 پس از 24 ساعت از 10 ميلي­گرم در ليتر به ترتيب به 6/38، 7/19، 7/09 و 5/74 ميلي­گرم در ليتر كاهش يافت. اين نتايج بيانگر انتقال موفق و نيز بيان ژن مورد نظر در باكتري است و اين باكتري نوتركيب مهندسي‌شده توانايي تجزيۀ تركيب‌هاي فسفره را دارد.

Organophosphorus compounds are widely used, and their presence in different components of the ecosystem has led to harmful effects on the environment. The use of microorganisms in detoxification of xenobiotic compounds and measurement of pesticide residues is considered as an environmental-friendly and appropriate method. Organophosphorus hydrolase (opd), is a phosphotriester hydrolase enzyme which is discovered in some soil microorganisms such as Flavobacterium sp. and has a wide range of substrates and is able to hydrolyze many organophosphorus compounds. In the present study, codon optimization was done to express the protein in Escherichia coli. Following omission of the signal peptide sequence and substitution of serine by methionine as the start codon, this fragment was cloned under the control of lac promoter in a promoter-probe vector (pTH1705) as a transcriptional fusion and was used for transformation in two Escherichia coli strains DH5α and XL1-blue. To measure the performance of the transgenic bacteria expressing opd gene (as in trans), they were cultured in M9 mineral medium containing 10 and 50 mg/L diazinon and appropriate available carbon and nitrogen sources. Studying the growth curve of V103 strain revealed that bacterial growth in the presence of 50 mg/L diazinon had been affected while this effect in the presence of 10 mg/L diazinon was minor. Results obtained from high-performance liquid chromatography as a standard method to compare with the performance of obtained transgenic strain showed that after 24 hours, diazinon concentration (initially 10mg/L ) in the bacterial culture medium of V100, V101, V102 and V103 strains reached to 6.38, 7.19, 7.09 and 5.74, respectively. These results reflected the successful transfer and expression of target gene in the bacterium and this genetically engineered bacterium was able to degrade organophosphorus compounds directly.