خاموشي سيستميك ژن كدكننده آنزيم تبائين -6- اُ- دمتيلاز در گياه دارويي خشخاش (Papaver somniferum L.) با استفاده از فن خاموشي ژن با القا ويروس

Systematic knockdown of thebaine 6-O-demethylase gene in Papaver somniferum L., using virus-induced gene silencing technique

گياه دارويي خشخاش (Papaver somniferum L.) بهعنوان يكي از مهمترين منابع تجاري براي برخي از آلكالوئيدهاي دارويي مانند ضد درد كدئين و مورفين و داروهاي نيمه مصنوعي مانند اكسي­كدون، بوپرونورفين و نالتروكسن ميباشد. از ژنهاي پائين‌دست مسير بيوسنتزي آلكالوئيدها در اين گياه، ژن تبائين -6- اُ- دمتيلاز (T6ODM) است كه بر توليد موادي مانند تبائين و اوريپاوين تأثيرگذار است. در اين پژوهش، اثر سازه خاموشي متكي بر فن VIGS، بر كاهش سطح بيان اين ژن در گياه خشخاش مطالعه شد. براي اين منظور، ابتدا با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي، cDNA ژن T6ODM تكثير شد و براي تأييد مورد توالييابي قرار گرفت. سپس بخشي از ژن به عنوان قطعه هدف خاموشي در ناقل ويروسي pTRV همسانهسازي شد و بهروش آگروباكتري، برگهاي گياه تراريخت شد. حضور ژن كدكننده پروتئين پوششي موجود در ناقل ويروسي در گياهان با استفاده از PCR بررسي و سطح بيان ژن در گياهان تراريخت توسط تجزيه‌و تحليل نيمه كمي و PCR در زمان واقعي بررسي شد. نتايج نشان داد كه ميانگين بيان ژن T6ODM در گياه حاوي سازه مورد نظر نسبت به گياهان شاهد 83/71 درصد كاهش داشت.

Papaver somniferum is one of the important commercial sources for several pharmaceutical alkaloids including the narcotic analgesics codeine and morphinane and the semi-synthetic drugs oxycodone, buprenorphine and naltrexone. One of the downstream genes in alkaloid biosynthesis pathway in the species is thebaine-6-O demetylase (T6ODM) that inverts thebaine and oripavine to codeinone and morphinone, respectively. In this study, a transient silencing construct based on virus-induced gene silencing (VIGS) technique was used to knockdown the T6ODM expression. In this regard, cDNA of T6ODM was prepared using specific primers and the results of reaction were sequenced for confirmation. Then, a part of resulted cDNA (silencing fragment) was selected for cloning in pTRV vector. The silencing construct was infiltrated to plant leaves via Agrobacterium tumefaciens. The presence of cp (coat proteine) gene of TRV vector was assayed by PCR and the positive TRV plants were screened for analysis of gene expression by semi quantitative and real-time PCR. Results of gene expression analysis showed that transgenic plants had a significant decrease in expression (with average amount of 83.71%), comparing to control plants.