بيان فاكتور رونويسي دوپامينرژيكي Nurr1 در سلول‏هاي انساني به‏وسيله لنتي ويروس‏هاي نوتركيب

هدف: هدف اين تحقيق توليد  لنتي ويروس‏هاي حامل ژن Nurr1 و بيان در سلول‏هاي انساني مي‏باشد. مواد و روش‏ها: قطعه ژني IRESEGFP با آنزيم‏هاي Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2EGFP جدا و با Klenow كور (Blunt) گرديد. ناقل لنتي ويروسي  pNLEGFP/CMV/WPREdU3 با آنزيم‏هاي Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن  كور شد.  قطعه ژني ايزوله شده به اين ناقل منتقل شد تا سازه لنتي ويروسي (I) به‏وجود آيد. سپس ژن Nurr1  با آنزيم‏هاي Xho1 و BamH1 از ناقل PCMXNOT بريده و درون پلاسميد (I) خطي شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهايي لنتي ويروسي (II) توليد گردد. براي توليد لنتي ويروس‏هاي نوتركيب، رده سلول انساني HEK293T  را با اين پلاسميد نهايي، به‏همراه پلاسميدهاي غشايي و بسته بندي لنتي ويروس ترانسفكت شد. محيط اين سلول‏ها كه مملو از ذرات ويروسي شده بود جمع آوري و از ستون آميكون عبور داده شد تا ذخيره غليظ ويروس به‏دست آيد. اين ذخيره براي آلوده سازي سلول‏هاي هدف استفاده شد. بيان EGFP در زير ميكروسكوپ به اثبات رسيد و بيان ژن Nurr1 با RTPCR سنجيده شد. نتايج: درستي مراحل كلونينگ با آنزيم‏هاي مربوطه اثبات شد. با ميكروسكوپ فلورسنس بيان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفكشن و ترانسدوكشن ثابت گرديد. تكنيك RTPCR بيان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانيد. نتيجه گيري: لنتي ويروس‏هاي ناقل ژن انساني Nurr1 توليد شده و به‏دنبال آلوده سازي سلول‏هاي انساني HEK293T با ويروس‏هاي مزبور، سلولهاي فوق ژن Nurr1 را به‏طور موفقيت آميز بيان كردند.