مهندسي پروتئين فعال كننده پلاسمينوژن بافتي (tPA) انساني با افزودن قطعه ژن كاسكوتين سس جهت افزايش پايداري و فعاليت آن

پروتئين tPA يك عامل اختصاصي فيبرين است كه موجب حل كردن لخته هاي خوني و جلوگيري از سكته ه ي قلبي و مغزي مي گردد. كاسكوتين يك پروتئاز با فعاليت و پايداري بالا مي باشد كه در گياهاني مثل سس وجود دارد و گياه پارازيت از آن براي نفوذ به ميزبان استفاده مي كند. هزينه توليد پروتئين هاي نوتوكيب در گياهان 10 الي 50 برابر كمتر از توليد همان پروتئين توسط باكتري است. اما توليد پروتئين-هاي نوتركيب در گياهان هنوز با چالش هاي مهمي از جمله عمليات پايين دستي و تخليص، پايين بودن فعاليت و پايداري پروتئين روبرو مي باشد. پروتئين نوتركيب tPA توليد شده در گياهان پايداري و فعاليت پاييني دارد. هدف اين تحقيق، افزايش پايداري tPA با استفاده از مهندسي پروتئين و افزودن جايگاه فعال آنزيم كاسكوتين از گياه سس به tPA و توليد پروتئين شيمري مي باشد. ابتدا از گياه سس استخراج DNA صورت گرفت و سپس با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي قطعه مورد نطر از ژن كاسكوتين تكثير گرديد. سپس به كمك تكنيك SOEing PCR قطعه كاسكوتين به ژن tPA متصل شد. قطعه tPA شيمري حاصله تحت كنترل پيشبر CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS قرار گرفت. توالي افزايش دهنده Kozak و ترادف رمز كننده پپتيد نشانه KDEL، به ترتيب به دو انتهاي آميني و كربوكسيلي ژن tPA افزوده شدند. سازه تهيه شده(pBI(tPA به روش انتقال ژن مبتني بر اگروباكتريوم به ژنوم گياه توتون منتقل و گياهان تراريخت روي محيط حاوي كانامايسين انتخاب شدند. ارزيابي گياهان تراريخت با استفاده از فنون PCR، RT-PCR، SDS-PAGE ، وسترن بلات و زيموگرافي انجام شد. نتايج نشان داد كه ژن شيمريtPA به گياهان توتون منتقل شده و در مقايسه با tPA نرمال فعاليت و پايداري آن بهبود يافته است. بنابراين مهندسي پروتئين و استفاده از بخش هايي از پروتئين هاي گياهي با فعاليت و پايداري بالاتر جهت افزايش ماندگاري و فعاليت داروهاي نوتركيب، مي تواند راهكار جديدي براي افزايش كارايي اين داروها باشد.