طراحي تلفيق ژني پلي اولئوزين-پروانسولين و انتقال آن به گياه كلزا (Brassica napus L.)

استفاده از ژن اولئوزين گياهي يك روش مناسب براي توليد و تجمع پروتئين نوتركيب در مقياس زياد و همچنين استخراج راحت تر و ارزان تر مي باشد. اتصال اولئوزين به ژن موردنظر، موجب هدف گيري پروتئين نوتركيب به اجسام روغني بذر مي شود. در سال هاي اخير، به منظور افزايش كارايي اولئوزين در توليد پروتئين نوتركيب، چند ژن اولئوزين (پلي اولئوزين)، به ژن هدف متصل مي شود. اين امر سبب توليد و تجمع پروتئين نوتركيب در سطوح اقتصادي در بذر مي گردد. از اين رو براي افزايش ميزان تجمع پروتئين پروانسولين در بذر گياه كلزا، يك سازه ي تلفيقي پلي اولئوزين-پروانسولين طراحي و ساخته شد. در طراحي اين توالي به ترتيب از سمت /5 توالي، يك توالي كزاك، يك برچسب هيستيدين، سه ژن اولئوزين، يك جايگاه پروتئوليتيكي براي پروتئاز، ژن پروانسولين و يك كدون پايان تترانوكلئوتيد قرار گرفت. اين تلفيق ژني پس از سنتز در ناقل pUC57 قرار داده شد. تلفيق ژني، پس از هضم آنزيمي به وسيله ي آنزيم هاي BamHI و SacI از pUC57 جداسازي و در ناقل دوتايي pBI121 همسانه سازي گرديد. پس از تائيد درج تلفيق ژني در ناقل pBI121 با استفاده از روش هاي PCR، هضم آنزيمي و توالي يابي، ناقل نوتركيب به سويه ي LBA4404 اگروباكتريوم انتقال داده شد. اين باكتري براي تراريختي ريزنمونه هاي كوتيلدون و هيپوكوتيل كلزا مورد استفاد قرار گرفت. نوساقه هاي باززايي شده در محيط انتخابي حاوي كانامايسين گزينش شدند. آناليز گياهان تراريخته در سطح DNA با استفاده از روش PCR انجام و يك قطعه ي 120 جفت بازي (مطابق با بخشي از ژن پروانسولين) تكثير شد. همچنين تكثير اين قطعه ي 120جفت بازي با روش RT-PCR، بيانگر بيان ژن هدف در گياهان تراريخته بود.