بيان هم زمان فاكتور رشد عصبي نوتركيب انساني با چاپرون تريگر فاكتور در E. coli

Co-expression of recombinant human nerve growth factor with trigger factor chaperone in E. coli

فاكتور رشد عصبي (NGF) يك فاكتور نوروتروفيك است كه در حفظ، بقا و تمايز سلول هاي سيستم عصبي نقش دارد. پروتئين NGF داراي سه زير واحد است كه زير واحد β آن فعاليت اصلي را بر عهده دارد. اين پروتئين از موتيف گره سيستئيني كه در آن رشته هاي β با پيوندهاي دي سولفيدي به يكديگر متصل شده اند، تشكيل شده است. NGF براي درمان بسياري از بيماري ها استفاده مي شود. به دليل اينكه NGF استخراج شده از منابع طبيعي براي درمان نامناسب است، بسياري از محققين براي توليد – NGFβ نوتركيب تلاش كرده اند. در اين مطالعه، به منظور افزايش بيان NGF، اين پروتئين به طور هم زمان با چپرون Trigger Factor در E. coli بيان شد. بدين منظور pET39b (+): : β-NGF و پلاسميد چپروني pTF16 به E. coli BL21 (DE3) انتقال يافتند. پس از القاي هر پروموتر، كل محتوي پروتئيني و پروتئين هاي پري پلاسمي بطور جداگانه استخراج شدند. به منظور تاييد تاثير TFبر ميزان بيان كلي و توليد –NGFβ محلول، تكنيك هاي برادفورد و دات بلات و نرم افزار ImageJ استفاده شدند. سپس –NGFβ با استفاده از ستون كروماتوگرافي تمايلي (Ni2+-NTA) تخليص شد. همچنين به منظور مطالعه عملكرد NGF-β تخليص شده، رده سلول هاي PC12 با پروتئين به مدت يك هفته تيمار شدند. داده ها نشان دادند كه بيان هم زمان با چپرون TF مي تواند سبب افزايش توليد پري پلاسمي و محلول –NGFβ و نه كل محتوي پروتئيني شود. همچنين تيمار سلول هاي PC12 با –NGFβ تخليص شده (بيان شده با چپرون TF) ، منجر به تمايز سلول هاي PC12 به سلول هاي عصبي شد، كه نشان دهنده عملكردي بودن پروتئين توليد شده است. داده هاي اين مطالعه نشان دهنده اين است كه بيان هم زمان چپرون سيتوپلاسمي TF با پروتئين NGF ممكن است يك روش موثر در توليد مناسب فاكتور رشد عصبي نوتركيب (rhNGF) محلول و فعال باشد.

Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophic factor that is functional in the survival, maintenance and differentiation of nervous system cells. This protein has three subunits, of which the beta subunit has the main activity. Its structure consists of a cysteine knot motif made up of beta strands linked by disulfide bonds. It can be used as a therapeutic agent in the treatment of many diseases. As NGF extracted from natural sources is unsuitable for therapeutic goals, many studies have attempted to produce recombinant β-NGF. In this study, Trigger Factor (TF) chaperone was expressed simultaneously with β-NGF in E. coli in order to obtain increased yield of soluble recombinant human β-NGF. For this purpose, pET39b (+)::β-NGF and chaperone plasmid pTf16 were transferred to E.coli (DE3 strain). After the induction of each promoter, the total proteins and periplasmic proteins were extracted. To confirm the effects of TF on total protein and soluble β-NGF expression level, Bradford and Dot blot techniques and ImageJ software were used. Then, β-NGF was purified using affinity chromatography column (Ni+2-NTA). Also, the PC12 cells were treated with the protein for one week in order to study the function of purified NGF. Our data indicated that co-expression of TF could increase the soluble and periplasmic production of β-NGF but not total proteins. Also, the treatment of PC12 cell line with purified β-NGF, co-expressed with TF chaperone, showed differentiation of these cells to nerve cells. This indicated that the purified NGF is fully functional. Our data suggest that the co-expression of cytoplasmic chaperone (TF) with recombinant nerve growth factor might be an efficient approach to produce a proper quantity of soluble and active rhNGF.