همسانه سازي و بيان آنتي‌ژن حفاظتي تغيير‌يافته باسيلوس‌آنتراسيس در باكتري E. coli

Cloning and Recombinant Expression modified protective antigen from Bacillus anthracis In E. coil

زمينه و هدف: سياه ­زخم يك بيماري مشترك بين انسان و دام است. عامل اين بيماري باكتري باسيلوس آنتراسيس مي­باشد. آنتي ژن حفاظتي تغيير يافته باسيلوس آنتراسيس براي درمان و واكسن قابل استفاده مي باشد. هدف اين مطالعه بيان آنتي ژن حفاظتي تغيير يافته باسيلوس آنتراسيس در باكتريE. coli مي­باشد. مواد و روش ها: قطعات ژني مورد نظر از پلاسميد pXOI تكثير و با عمل SOEiong PCR قطعه بدست آمده در كلونينگ وكتور همسانه­ سازي گرديد و بعد از جداسازي به وكتور pET28a(+) زيرهم سانه ­سازي و به باكتري E.coli سويه BL21(DE3) تراريخت شد. بيان آنتي ژن حفاظتي تغيير يافته باسيلوس آنتراسيس تحت القايIPTG انجام و بعد از تخليص پروتئين با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي، آنتي­ژن حاصل در چهار نوبت به موش ­هاي سوري تزريق شد. آنتي­ بادي پلي­كلونال توليد شده در سرم موش­ها اندازه­ گيري گرديد. يافته ها: آنتي ژن حفاظتي تغيير يافته باسيلوس آنتراسيس كلون شده در وكتور بياني pET28a(+) به وسيله­ي PCR، آناليز آنزيمي و توالي يابي تأييد گرديد. پروتئين نوتركيب توليد شده به وسيله SDS-PAGE و لكه­ گذاري وسترن تاييد شد. سرم از خون موش جداسازي شد و تيتر آنتي بادي عليه PA تغيير يافته از طريق الايزاي غير مستقيم ارزيابي گرديد. نتيجه گيري: پروتئين توليدي داراي خاصيت مهار كنندگي بالايي براي فاكتورهاي بيماريزاي LF و EF مي باشد. با توجه به شناسايي آنتي ژن PA بوسيله آنتي بادي آنتي ژن حفاظتي تغيير يافته باسيلوس آنتراسيس، مي­توان به­ صورت مجزا، يا تركيبي با ساير دومن هاي PA در طراحي واكسن و بعنوان دارو براي درمان و پيشگيري بيماري سياه­ زخم استفاده نمود.

Background: Anthrax is a common illness between human and animal which the agent of that is Bacillus anthracis. The modified protective antigen cab be used in treatment and vaccination. The aim of this study is the recombinant expression of modified protective antigen in E. coli. Material and Methods: Gene fragments were amplified with PCR from pXOI and fusion gene from SOEing PCR was cloned in a cloning vector and finally sub cloned in pET28a(+) vector and transferred to E. coli BL21(DE3) competent cells. Recombinant expression of modified PA was induced by IPTG and after protein purification with affinity chromatography, resulted antigen was injected to mice in 4 repeats. Polyclonal antibodies produced in mice serum was accessed. Results: The modified protective antigen cloned in expression vector pET28a(+) was confirmed by PCR, enzymatic digestion and sequencing. Recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and western blot. Serum was separated from mice blood and titre of antibody against modified PA was assessed by indirect ELYSA. Conclusion: resulted protein has high inhibitory property for LF and EF virulence factors. By consideration in PA detection by polyclonal antibody against modified PA from Bacillus anthracis, it can be used in for treatment and prophylaxis against anthrax in individual or combination forms with other PA domains.