واكنش گياهان تراريخته برنج حاوي ژن EPSPS به علف‌كش گلايفوسيت

The reaction of transgenic rice plants containing EPSPS gene to glyphosate

يكي از مؤثرترين راه‌هاي ايجاد گياهان مقاوم به علف كش گلايفوسيت، دستورزي ژن كد كننده آنزيم EPSPS به منظور كاهش ميل تركيبي گلايفوسيت به اين آنزيم است. EPSPS از آنزيم‌هاي مسير شيكيمات بوده كه مسئول ساخت اسيدهاي آمينه حلقوي و نيز انواع متابوليت‌هاي ثانويه در گياهان و باكتري‌ها است. بدون حضور آنزيم فوق، موجود قادر به ادامه حيات نخواهد بود. در تحقيق حاضر يكي ازدومين‌هاي مهم جهت اتصال آنزيم EPSPS كه اسيدآمينه گلايسين 96 است، به روش جهش‌زايي نقطه‌اي به‌واسطه مگاپرايمر در تك تيوپ از واكنش PCR به اسيدآمينه آلانين تغيير داده شد. ژن تغيير يافته (EPSPS)، به همراه ژن تيپ وحشي (35S:EPSPS) جداگانه در وكتور بياني pPZPY122 كلون و به واسطه سويه سوپربيماريزاي EHA105 ازAgrobacterium tumefaciens به جنين بالغ گياه برنج (Oryza sativa L.) در رقم هاشمي به روشin planta انتقال يافتند. تأييد مولكولي تراريزش در دو نسل از گياهان برنج به روش PCR انجام شد. همچنين تأييد فنوتيپي بر اساس مقاومت به آنتي‌بيوتيك جنتامايسين و نيز مقاومت به علفكش گلايفوسيت در غلظت‌هاي مختلف انجام شد. در نهايت بررسي مقدار بيان ژن‌هاي انتقال يافته در نسل دوم به واسطه qPCR انجام شد. نتايج نشان دهنده بيان هر دو ژن در گياهان مورد آزمايش بود. در اين مطالعه مشخص شد كه فرابيان ژن موتانت سبب توليد گياهان با مقاومت بالاتر به علف كش در مقايسه با گياهان شاهد غيرموتانت و همچنين گياهان با فرابيان ژن وحشي شده است.

The most effective way to produce a plant resistant to glyphosate is manipulation of EPSPS enzyme in order to reduce its affinity to this herbicide. It is one of the vital enzymes in the shikimate pathway, which is responsible for producing aromatic amino acids and various secondary metabolites in plants and bacteria. Without an active enzyme, the organism will not be able to survive. In the present study, one of the important domains in the EPSPS enzyme was modified by site-directed mutagenesis using mega-primer method and one tube approach. Glycine in position 96 was modified to Alanine which was sub-cloned along with the wild-type gene into pPZPY122 plant binary vector. Hashemi cultivar of rice (Oryza sativa) was used for transformation using EHA105 strain of Agrobacterium tumefaciens by in planta method. T2 transgenic plants separately were evaluated to resistance to the gentamicin and glyphosate. Also, positive gene expression was confirmed by Quantitative PCR. Therefore, based on the results, these plants showed significantly a high degree of resistance to the herbicide.