ارزيابي سريع پيشبرهاي بذري در برگ با استفاده از فاكتور رونويسي LEC2

Rapid assessment of seed promoters in leaves by using LEC2 transcriptional factor

فاكتور رونويسي LEC2 يكي از فاكتورهاي رونويسي است كه با اتصال به توالي پيشبرهاي بذري سبب بيان ژن­هاي پايين دستي مي­شود. استفاده از اين فاكتور رونويسي در كنار روش آگرواينفيلتريشن مي­تواند زمان ارزيابي پيشبرهاي بذري را با توجه به حذف زمان طولاني مدت انتقال دائم تا بذردهي كاهش دهد. در اين تحقيق اختصاصي بودن بيان بذري ژن تحت كنترل پيشبر FAD2-1 پس از جداسازي از گياه گلرنگ با استفاده از آناليز بيان ژن GUS در برگهاي توتون مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج توالي­يابي پيشبر FAD2-1 نشان داد كه اين قطعه جدا شده از بالادست ژن FAD2-1 حاوي عناصر اساسي براي بيان اختصاصي در بذر است. جهت ارزيابي سريع اختصاصي بودن بيان بذري در پيشبر ژن FAD2-1 دو كاست ژني طراحي گرديد: كاست ژني اول pFAD2-GUS (ژن GUS و پيشبر ژن (FAD2-1 و كاست ژني دوم pBI-LEC2 (ژن LEC2 و پيشبر 35S). كاست­هاي ژني به صورت جداگانه در وكتور pBI121 كلون شده و در نهايت به سويه EHA105 آگروباكتريوم منتقل شدند. به منظور بررسي سريع عملكرد اين پيشبر، آگروباكتريوم­هاي حاوي دو سازه بصورت جداگانه آماده و كشت شده و پس از تنظيم غلظت هر دو كشت بر روي OD600=0.6 به نسبت مساوي با هم مخلوط و به برگهاي توتون تزريق شد. با آبي شدن برگهاي تزريق شده با سازه يك+سازه دو و عدم مشاهده رنگ در برگهاي تزريق شده با سازه يك يا سازه دو اختصاصي بودن بيان بذري اين پيشبر تاييد شد. نتايج نشان داد كه فاكتور رونويسي LEC2 با شناسايي توالي­هاي خاص در بالادست ژنهاي بذري سبب بيان ژنهاي پايين دستي مي­شود. از اينرو اين تحقيق پيشنهاد مي­كند كه فاكتور رونويسي LEC2 به همراه روش آگروينفيلتريشن مي­تواند به عنوان ابزاري كارا و سريع در تاييد قطعاتي كه بالقوه به عنوان پيشبر بذري جداسازي مي­شوند، استفاده شود.

LEC2 as a transcriptional factor attaches to seed-specific promoters and induces the expression of downstream genes. Analysis of permanent gene transfer in plants is time-consuming and has long process. Using this transcription factor along with the agroinfiltration method can reduce significantly the time of seed specific promoter evaluation. In this research, seed specificity of FAD2-1 promoter, isolated from safflower plants, was studied by GUS expression analysis in tobacco leaves. Fad2-1 promoter sequence analysis indicated that this promoter is containing essential elements for seed-specific function. For analyzing FAD2-1 promoter function, we constructed two gene cassettes: pFAD2-GUS (GUS gene under the control of FAD2-1 promoter) and pBI-LEC2 (LEC2 gene under the control of CaMV35S promoter). These cassettes were cloned in pBI121 vector and transferred to Agrobacteriun tumefacience EHA105, separately. For seed-specific function analysis of FAD2-1 promoter in tobacco leaves, the overnight culture of Agrobacteriums were adjusted to OD600=0.6, mixed equally and then used to infiltrate into tobacco leaves. GUS assay analysis of infiltrated leaves indicated the specific expression of the reporter gene (GUS). Therefore, FAD2-1 promoter is suggested as a seed specific promoter. Our results suggest that LEC2 along with agroinfiltration method can use as a rapid and confident tool for verifying seed specific expression of any seed-specific promoters.