همسانه سازي و ساخت وكتور بياني ژن گلوتامات دكربوكسيلاز باكتري لاكتوباسيلوس پلانتاروم

Cloning and Expression Vector Construction of Glutamate Decarboxylase Gene from Lactobacillus Plantarum

سابقه و هدف: گاما آمينو بوتيريك اسيد (گابا) يك اسيدآمينه چهار كربنه غير پروتئيني است كه در درمان فشارخون، ديابت، التهاب و افسردگي مي تواند بكار رود. گابا توسط آنزيم گلوتاميك اسيد دكربوكسيلاز در بسياري از موجودات شامل باكتري‌ها سنتز مي شود. از اينرو همسانه سازي اين آنزيم جهت بهينه‌سازي توليد گابا اهميت دارد. هدف از اين پژوهش همسانه سازي و ساخت وكتور بياني حاوي ژن گلوتامات ­دكربوكسيلاز از باكتري لاكتوباسيلوس پلانتاروم PTC1058 است. مواد و روش­ها: در يك مطالعه تجربي خصوصيات مورفولوژيك، بيوشيميايي، ژنتيكيِ و توالي يابي 16s rDNA سويه لاكتوباسيلوس پلانتاروم1058 بررسي شد. سپس DNA ژنوميك اين باكتري جدا و با استفاده از PCR ژن گلوتامات­دكربوكسيلاز تكثر شد. سپس اين ژن در حامل كلونينگ pJET1.2/Blunt وارد و در حامل pET32a ساب كلون گرديد. حامل پلاسميد بياني pET32a-gad در اشريشياكلي سويه BL21 ترانسفورم گرديد و بيان پروتئين با استفاده از SDS-PAGE بررسي شد. يافته ­ها: يافته‌هاي به دست آمده از بررسي‌هاي مورفولوژيك، بيوشيميايي و ژنتيكيِ توالي يابي 16s rDNAنشان داد كه زير سويه‌ي مورد بررسي مربوط به سويه لاكتوباسيلوس پلانتاروم است. نتيجه­ ي توالي يابي قطعه­ي تكثيرشده با استفاده از PCR وجود ژن گلوتامات دكربوكسيلاز را نشان داد. در پايان نتيجه كلنيPCR و آناليز SDS-PAGE، صحت همسانه­سازي و بيان آنزيم در سويه­ي نوتركيب BL21را تأييد كرد. نتيجه گيري: اين مطالعه همسانه سازي موفق ژن گلوتامات دكربوكسيلاز از لاكتوباسيلوس پلانتاروم1058 را نشان داد. ژن همسانه سازي شده مي تواند در سيستم‌هاي پروكاريوتي و يوكاريوتي سريع رشد و استفاده از محيط كشت‌هاي ارزان‌تر و حتي پسماند­هاي غيرقابل بازيافت به كاربرد

BACKGROUND and OBJECTIVE: Gamma-aminobutyric acid (GABA) is a four-carbon non-protein amino acid used in the treatment of hypertension, diabetes, inflammation, and depression. GABA is synthesized by glutamic acid decarboxylase (GAD) enzyme in many organisms, including bacteria. Therefore, cloning of this enzyme is essential to the optimization of GABA production. This study aimed to clone and construct the expression vector of GAD gene from Lactobacillus plantarum PTCC 1058 bacterium. METHODS: In this experimental study, we investigated the morphological, biochemical, genetic and 16s rDNA sequencing of L. plantarum PTCC 1058 strain. Genomic DNA of the bacterium was isolated and amplified using the GAD gene via polymerase chain reaction (PCR). Afterwards, the gene was inserted into the pJET1.2/blunt cloning vector and subcloned in vector pET32a. Plasmid pET32a-gad expression vector was transformed in Escherichia coli BL21 strain, and protein expression was assessed using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). FINDINGS: Morphological, biochemical and genetic analyses of 16s rDNA sequencing indicated that the studied substrain was of the L. plantarum strain. In addition, results of nucleotide sequencing of the fragmented segment via PCR showed the presence of GAD gene. Results of colony PCR and SDS-PAGE analysis confirmed the accuracy of the cloning and gene expression of the recombinant Escherichia coli BL21 strain. CONCLUSION: According to the results of this study, cloning of GAD gene from L. plantarum PTCC 1058 was successful. These cloned genes could grow rapidly in prokaryotic and eukaryotic systems and be used in cost-effective culture media and even non-recyclable waste.