كلون سازي cDNA سيستاتين ذرت (CCs)، و ارزيابي اثر بازدارندگي پروتئين آن در شرايط آزمايشگاهي

Cloning of Corn Cystatin cDNA and Evaluation of Its Protein Inhibitory Effect in vitro

جداسازي و كلون سازي ژن‌هاي نوتركيب بازدارنده پروتاز (PIs)گياهي و انتقال آنها به ژنوم گياهان ديگر، راه را براي مقاومت گياهان تراريخته در مقابل بعضي آفات مهاجم هموار ساخته است. در پژوهش حاضر با علم به قدرت مهاركنندگي سيستاتين‌ها به‌عنوان عامل مهاركننده پروتاز سيستئين، ژن‌هاي سيستاتين از ژنوم ذرت جداسازي گرديد. cDNA مربوط به اين ژن‌ها با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي در محيط آزمايشگاه ساخته شد و پس از خالص سازي محصول RT - PCR در ناقل‌هاي پلاسميد pUC19 و pGEX 2T كلون گرديد. ناقل‌هاي پلاسميد نوتركيب (حاوي سيستاتين‌هاي ذرت) با استفاده از دستگاه شوك الكتريكي به سلول‌هاي مستعد اشرشياكولي Dh5α انتقال داده شدند. سلول‌هاي مستعد حاوي كلون‌هاي نوتركيب در محيط كشت مساعد رشد داده شدند و پروتئين‌هاي سيستاتين متصل به گلوتاتيون-اس-ترانسفراز (GST) با استفاده از فيلتر گلوتاتيون آگاروز بيد (Glutation Agarose Bead) خالص سازي گرديدند. در هر مرحله از پيشرفت كار وجود ژن‌هاي سيستاتين به‌وسيله الكتروفورز نمونه‌ها مورد تأييد قرار گرفت. در آزمايش‌هاي بعدي اثر بازدارندگي پروتئاز و پايداري نسبي سيستاتين‌هاي نوتركيب مورد ارزيابي قرار گرفت.

Isolating and cloning of plant protease inhibitor (PIs) genes and transforming them to the genome of other plants have paved the way for producing resistant transgenic plants against pests. Knowing that cystatins act as inhibitor factor against cysteine protease, short and long cystatin genes were isolated from maize mRNA. By using specific primers, cDNA of these genes were constructed and cloned in pUC19 and pGEX 2T plasmid vectors. The recombinant plasmid vectors were then transformed to E. coli (strain DH5 α) competent cells using electroporation. The competent cells harboring the clones were grown in suitable medium and cystatin proteins fused to Glutation-S-transferase (GST) were purified by glutation agarose bead filter. In each step of the procedure the presence of cystatin genes were confirmed through electrophoresis. Further evaluation proved the inhibitory effect and a mild stability of at least one of the corn cystatin (CC II) when incubated with cysteine protease.