شناسايي آپتامر dnaاي با تمايل بالا عليه آنتي‌ژن سطحي هپاتيت b با روش تكامل سيستماتيك ليگاند از طريق غني‌سازي نمايي

Detection of DNA Aptamer with High Affinity against Hepatitis B Surface Antigen by Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment

اهداف: هپاتيت b عفونت ويروسي است كه مي تواند منجر به مشكلات جدي كبدي شود. براي توليد واكسن هپاتيت b از آنتي ژن سطحي ويروس هپاتيت b (hbsag) كه به صورت نوتركيب توليد مي شود، استفاده مي شود. هدف پژوهش حاضر شناسايي آپتامر dnaاي با تمايل بالا عليه آنتي ژن سطحي هپاتيت b با روش تكامل سيستماتيك ليگاند با استفاده از غني سازي نمايي بود.مواد و روش ها: در پژوهش تجربي حاضر با استفاده از روش تكامل سيستماتيك ليگاند از طريق غني سازي نمايي (​selex( قطعه dnaاي با قدرت اتصال بالا عليه hbsag، جداسازي و توالي يابي شد. تمايل اين توالي نوكلئوتيدي تك رشته اي با روش فلوريمتري محاسبه شد. اختلاف جذب اوليه و مقدار باقي مانده به عنوان معياري از ميزان توالي هاي متصل شده با كمك نرم افزار prism 5 به روش رگرسيون غيرخطي، محاسبه bindingsaturation و مدل one sitetotal انجام و ميزان ميل تركيبي (kd) تعيين شد.يافته ها: نتايج بعد از انجام رويه selex و ارزيابي توالي تكثيريافته با ژل آگارز، نمونه كنترل مثبت داراي باندي در محدوده 72نوكلئوتيد بود كه نشان دهنده تكثير موفق توالي گزينش شده با استفاده از آغازگزهاي انتخابي بود. ميل تركيبي محاسبه شده 81/53نانومولار بود. طي مراحل همسانه سازي از روي كلني هاي موجود واكنش pcr با آغازگرهاي اختصاصي آپتامر، حضور قطعه آپتامر در باكتري اشريشيا كلي تاييد شد. آپتامر گزارش شده داراي ساختار ثانويه پايدار با داشتن انرژي آزاد g delta; كمتر از 9/6كيلوژول و tm بالاتر از c deg;45 بود.نتيجه گيري: آپتامر dnaاي گزينش شده داراي قدرت اتصال بالا به پروتئين هدف (hbsag) است و مي تواند به عنوان جايگزيني براي پادتن ها، در ستون هاي كروماتوگرافي تمايلي تخليص hbsag مورد توجه قرار بگيرد.

Aims Hepatitis B is a viral infection, which can cause serious liver problems. Hepatitis B surface antigen (HBsAg), which is produced as recombinant, is used to produce the Hepatitis B vaccine. The aim of this study was to detect DNA aptamer with high affinity against HBsAg by Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX). Materials & Methods In the present experimental study, SELEX method was used to isolate and sequence a DNA aptamer with high affinity against HBsAg. The affinity of this monoclonal nucleotide sequence was calculated by fluorimetric method. The difference of initial absorption and residual value as a measure for the number of associated sequences were calculated with Prism 5 software by nonlinear regression method, Binding-saturation and one site-total model were performed, and the amount of electron affinity (Kd) was determined. Findings After performing the SELEX procedure and evaluating the amplified sequence with agarose gel, the result was positive control sample containing a bond in the range of 72nucleotides, indicating successful amplification of the selected sequence, using selective primers. During cloning steps from existing colonies of PCR reaction with aptamer specific primers, the presence of aptamer was confirmed in Escherichia coli bacteria. The reported aptamer had a stable secondary structure with a free energy of ΔG of less than -6.9kJ and Tm higher than 45°C. Conclusion The selected DNA aptamer has a high affinity to the target protein (HbsAg) and can be considered as an alternative for mAbs in chromatography column.