افزايش پايداري حرارتي پروتئين نوتركيب اينورتاز ساكارومايسس سرويزيه با ايجاد جهش‌هاي هدفمند

Increasing Thermal Stability of Saccharomyces cerevisiae Recombinant Protein Invertase by Site-directed Mutagenesis

اهداف: اينورتاز آنزيمي است كه به صورت گسترده در صنايع مورد استفاده قرار مي گيرد. منبع اصلي توليد صنعتي آنزيم اينورتاز مخمر ساكارومايسس سرويزيه است. افزايش پايداري حرارتي در اين آنزيم كمك مهمي به افزايش بهره وري در توليد مربوطه خواهد كرد. هدف پژوهش حاضر افزايش پايداري حرارتي پروتئين نوتركيب اينورتاز ساكارومايسس سرويزيه با ايجاد جهش هاي هدفمند بود.مواد و روش ها: در پژوهش تجربي حاضر، با الگوقراردادن آنزيم اينورتاز باكتري گرمادوست ترماتوگا ماريتيما به منظور افزايش پايداري حرارتي، اسيدآمينه هاي ترئونين 345 و آسپارژين 349 در ژن پروتئين اينورتاز ساكارومايسس سرويزيه با روش جهش زايي هدفمند با آلانين جايگزين و در مخمر پيكيا پاستوريس همسانه سازي با واكنش زنجيره اي پليمراز soeing انجام شد. فعاليت آنزيم هاي نوتركيب اينورتاز طبيعي و جهش يافته در دماهاي مختلف، phهاي مختلف، مدت زمان پايداري و پايداري حرارتي عملكردي اندازه گيري و نمودار ميكائيليس منتن رسم شد.يافته ها: پايداري حرارتي ساختاري آنزيم هاي طبيعي و جهش يافته اينورتاز در دماي 55 °c نشان داد كه آنزيم جهش يافته در دماي 55 °c نسبت به آنزيم طبيعي پايدراي حرارتي بالاتري داشت. هر دو آنزيم طبيعي و جهش يافته در پايداري عملكردي روند مشابهي را نشان دادند. كاهش km و افزايش vmax در سوبستراي ساكاروز و افزايش 5برابري نسبت kcat/km در آنزيم جهش يافته ديده شد.نتيجه گيري: جهش هاي هدفمند اعمال شده هيچ اثر منفي روي ميزان توليد و همچنين ترشح پروتئين نوتركيب اينورتاز ندارد و باعث افزايش فعاليت آنزيم مي شود. آنزيم جهش يافته نسبت به آنزيم طبيعي، پايداري ساختاري بالاتري دارد، بدون اين كه تغييري در پايداري عملكردي آن ايجاد كند.

Aims Invertase is an enzyme that is widely used in industries. The main source of industrial production of invertase is yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Increasing thermal stability makes an important contribution to improving productivity in related production. The aim of this study was increasing thermal stability of Saccharomyces cerevisiae recombinant protein invertase by site-directed mutagenesis. Materials & Methods In the present experimental study, using invertase enzyme from thermophilic bacteria, Thermotoga maritima as template, it was decided to replace the threonine 345 and asparagine 349 amino acid with alanine, using site-directed mutagenesis and in Pichia pastoris, cloning was performed with the SOEing polymerase chain reaction. The activity of natural and mutant recombinant invertase enzymes at different temperatures, different pHs, stability duration, and thermal-performance stability, and Michaelis–Menten kinetics were drawn. Findings The thermal-structural stability of the natural and mutant invertease enzymes at 55°C showed that the mutant enzyme had a higher thermal stability at 55°C compared with the natural enzyme. Both natural and mutant enzymes exhibited a similar trend in functional stability. Reduction of Km and increase of Vmax in sucrose substrate and 5-fold increase in Kcat/ Km ratio of mutant enzyme was observed. Conclusion Site-directed mutagenesis has no negative effect on the amount of production as well as the secretion of recombinant protein invertase and increases enzyme activity. The mutant enzyme has a higher structural stability than the natural enzyme without altering its functional stability.