جداسازي،كلونينگ و بررسي ويژگي هاي بيوانفورماتيكي ژن دلتا15 دسچوراز از مخمر Pichia pastoris GS115 جهت افزايش توليد اسيد چرب آلفالينولنيك اسيد در دانه هاي روغني

Isolation, cloning and bioinformatics analyses of the Delta 15 desaturase gene from the yeast Pichia pastoris GS115 in order to increasing of alpha-linolenic acid content of oilseeds

اسيدآلفالينولنيك يكي از اجزاي تشكيل دهنده اسيدهاي چرب امگا3 مي باشد كه براي حفظ سلامت بدن انسان ضروري بوده ولي در داخل بدن انسان ساخته نمي شوند. هدف از اين پژوهش همسانه سازي ژن دلتا15دسچوراز به منظور افزايش توليد اسيدآلفالينولنيك در گياهان دانه روغني مي باشد. بدين منظور، پس از استخراج RNA و سنتز cDNA از مخمر پيكيا پاستوريس سويه GS115، اين ژن توسط پرايمرهاي اختصاصي حاوي توالي كوزاك تكثير، و جهت توالي يابي در وكتورPTZ57R/T همسانه سازي شد. قطعه نوتركيب پس از تاييد توالي از وكتور TA جدا و به pBluescript KS(+) حاوي پروموتر ناپين الحاق شد. سپس سازه ژني طراحي شده جهت انتقال به گياه، در ناقل دوگانه pBI121 همسانه سازي و به آگروباكتريوم توميفاسينس سويه LBA4404، منتقل شد. خصوصيات بيوانفورماتيكي ژن مورد بررسي توسط ابزارهايي مانندTopPred TMHMM,، ProtParam وSOPMA بررسي گرديد. نتايج واكنش PCR و تكثير قطعه اي به طول bp1246 صحت همسانه سازي اين ژن را تاييد كرد. همچنين تكثير قطعه اي به طول bp 1210 توسط پرايمرهاي داخلي پروموتر ناپين و ژن دلتا 15دسچوراز، و نيز ايجاد قطعه bp 2145 در هضم آنزيمي، تاييدي بر الحاق صحيح اين ژن در امتداد پروموتر ناپين بود. نتايج توالي يابي نوكلئوتيدي نشان داد كه توالي كد كننده اين آنزيم مشتمل بر 1246 نوكلئوتيد و كد كننده 415 اسيد آمينه مي باشد. آناليز توالي آمينواسيدي وجود دو دومين و 5 هليكس تراغشايي را تاييد كرد. همچنين پيش بيني خواص پروتئيني، بررسي سيگنال پپتيدها و ساختار دوم، ثابت كرد كه اين آنزيم جزء آنزيم هاي پايدار و غشايي مي باشد.

Alpha-linolenic acid is an omega-3 fatty that is essential for maintaining a healthy body but can't produce in the human body. The oils of some oilseeds, as well as some plants are the main sources of alphalinolenic acid but the content of alpha-linolenic acid, in important oilseed plants like soybean and rapeseed are relatively low. The aim of this study was the cloning of Delta 15 Desaturase gene to increase alpha-linolenic acid production in the oilseed plants. For this purpose, after extracting total RNA and cDNA synthesis from Pichia pastoris GS115, the gene was amplified using gene-specific primers containing Kozak sequence and then cloned in PTZ57R / T vector and transformed into E.coli strain DH5α. After sequencing, the recombinant fragment was isolated from TA vector and was cloned into pBluescript KS(+) vector containing Napin promoter. The designed gene construct was cloned in pBI121 binary vector and then was transformed into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Bioinformatics characterization of the target gene was investigated by servers TopPred, TMHMM, ProtParam and SOPMA. The results of the colony PCR and amplification of the 1246 bp fragment, confirmed the accuracy of the gene cloning. The amplification of a 1210 bp fragment using an internal primer of napin promoter and Delta 15 desaturase, as well as the production of the 2145 bp fragment in enzymatic digestion confirmed the correct incorporation of the gene along with Napin promoter. Nucleotide sequencing results showed that the cloned CDS include 1246 nucleotides and translated to a protein with 415 amino acids. The amino acid sequence analysis confirmed the presence of two domains and five Transmembrane helices. Also, prediction of the protein's properties, signal peptides, and the second structure, proved that this enzyme is stable transmembrane enzymes.