خالص سازي و تعيين ويژگي هاي بيوشيميايي آنزيم گلوتاتيون اس- ترنسفراز از پسيل معمولي پسته (Agonoscena pistaciae Burckhardt and Lauterer (Hemiptera: Psyllidae

Purification and biochemical characterization of glutathione S-transferase from common pistachio psyllid, Agonoscena pistaciae Burckhardt and Lauterer (Hemiptera: Psyllidae)

آنزيم گلوتاتيون اس- ترنسفراز (GST) از حشرات بالغ پسيل پسته، Agonoscena pistaciae Burckhardt and Lauterer به واسطه رسوب گذاري سولفات آمونيوم و كروماتوگرافي ميل تركيبي با بكارگيري ستون Glutathione Sepharose 4B جداسازي و خالص شد. آنزيم خالص شده بصورت تك باند درSDS-PAGE ظاهر شد و وزن مولكولي آنزيم 4/28 كيلو دالتون تخمين زده شد. آنزيم از پسيل پسته به صورت 27/39 برابر و با درصد بازيابي 37/12 خالص سازي شد و آنزيم خالص شده، فعاليت ويژه 08/30 U mg-1 protein نشان داد. دما و pH بهينه فعاليت آنزيم به ترتيب 30 درجه سلسيوس و 9 به دست آمد. مقادير Km و Kcat براي سوبستراي GSH (Glutathione) به ترتيب 44/0 mM و 9/152 s−1 محاسبه شد و براي سوبستراي CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 33/0 mM و 7/207 s−1 به دست آمد. فعاليت آنزيم GST به طور كامل با اضافه كردن EDTA، ZnCl2 و SDSمتوقف شد، اين در حالي است كه CaCl2، BaCl2، CoCl2، Hg2Cl2، MgCl2،Urea، MnCl2 وKCl به طور جزئي فعاليت آنزيم را متوقف كرد. مطالعات بازدارندگي in vitro نشان داد كه تمام آفت­ كش ­هاي شيميايي (از جمله: ايميداكلوپريد، استامي پرايد، فوزالون و آميتراز) بر فعاليت آنزيم خالص شده GST اثر بازدارندگي دارند. نتايج مطالعه ما با گسترش اطلاعات بيوشيميايي آنزيم GST حاصل از پسيل معمولي پسته، به درك مكانيسم هاي مقاومت در اين آفت كليدي كمك مي كند.

Glutathione S-transferase (GST) was purified and isolated from adults of common pistachio psyllid, Agonoscena pistaciae Burckhardt and Lauterer, by using ammonium sulfate precipitation and affinity chromatography using Glutathione Sepharose 4B column. The purified enzyme appeared as a single band on SDS-PAGE with an apparent molecular weight of 28.4 kDa. GST was purified 39.27-fold with a yield of 12.37% and a specific activity of 30.08 U mg-1 protein from A. pistaciae. The optimum temperature and pH of the enzyme activity were 30 °C and 9.0, respectively. The Km and Kcatvalues for GSH (Glutathione) substrate were also determined to be 0.44 mM and 152.9 s−1 and for CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene) substrate to be 0.33 mM and 207.7 s−1, respectively. GST’s activity was completely inhibited by the addition of EDTA, ZnCl2, andSDS; however, partially inhibited by CaCl2, BaCl2, CoCl2, KCl, MnCl2, Urea, MgCl2 and Hg2Cl2. The in vitro inhibition studies indicated that all kinds of conventional insecticides (i.e. imidacloprid, acetamiprid, phosalone, and amitraz) possessed inhibitory effects on the activity of purified GST. Our study broadens the biochemical information on A. pistaciae’s GST and this information will help us to understand the mechanisms of insecticide resistance in this key pest.