بررسي هم‌خواني دو نوع پرايمر RT-PCR جهت تشخيص ويروس آنفلوانزاي پرندگان (H9N2)

هدف از انجام اين تحقيق استفاده از دو نوع پرايمر RT-PCR براي تشخيص ويروس آنفلوانزاي H9N2 پرندگان و مقايسه هم‌خواني اين دو روش نسبت به همديگر بود تا مشخص شود كدام روش در رقت‌هاي متوالي تهيه شده داراي آستانه تشخيص بيشتري است. براي اين منظور ميزان EID50 ويروس آنفلوانزايي كه با استفاده از كشت و كيت‌هاي تجاري مورد تاييد قرار گرفته بود، با استفاده از روش Reed and Muench مشخص شد. تيتر ويروس 10^6  EID50 در ميلي‌ليتر بود. از ويروس آنفلوانزاي مذكور اقدام به تهيه رقت بر اساس لگاريتم دو شد و با استفاده از كيت RNA Pure ساخت شركت سيناژن اقدام به خالص‌سازي ژنوم موجود در نمونه‌هاي رقيق شد. پس از تهيه cDNA براي تشخيص ويروس آنفلوانزا از پرايمرهاي منتشر شده در مقالات Wu et al. 2008 و Spackman et al. 2002 استفاده شد. واكنش‌هاي RT-PCR براي تشخيص ژن ماتريكس (M) ويروس آنفلوانزاي پرندگان بود كه هر كدام به ترتيب قطعاتي به اندازه 131 و 100 جفت باز را تشخيص مي‌دهند. همچنين براي اطمينان از اختصاصي بودن دو جفت پرايمر مذكور از نمونه ويروس‌هاي واكسن برونشيت H120 و ويروس واكسن نيوكاسل B1 به عنوان كنترل منفي استفاده شد. هر دو روش نسبت به تشخيص ويروس آنفلوانزا اختصاصي بودند و هيچ كدام از روش‌هاي مذكور در مورد ويروس برونشيت و نيوكاسل باند تشكيل ندادند. روش  Wu et al. 2008 تا رقت 1:4096 و 168 كپي از ژنوم در ميلي‌ليتر و روش Spackman et al. 2002 تا رقت 1:2048 و 336 كپي از ژنوم در ميلي‌ليتر توانستند مشخص كنند. لذا پرايمرهاي مربوط به روش  Wu et al. 2008 حساس‌تر از روش ديگر مي‌باشد.