عنوان مقاله :
مسانه‌سازي ژن و بيان دُمين عملكردي ترومبوپويتين به‌صورت محلول با به‌كارگيري ميزبان بياني رزتاگامي
عنوان به زبان ديگر :
Gene cloning and expression of soluble thrombopoietin functional domain by harnessing Rosetta-gami expression system
پديد آورندگان :
مرادي، محمد موسسه عالي آموزشي و پژوهشي طب انتقال خون - مركز تحقيقات انتقال خون - گروه بيوتكنولوژي، تهران , عطاردي، كامران موسسه عالي آموزشي و پژوهشي طب انتقال خون - مركز تحقيقات انتقال خون - گروه هماتولوژي , محمدي‌پور، مهشيد موسسه عالي آموزشي و پژوهشي طب انتقال خون - مركز تحقيقات انتقال خون - گروه بيوتكنولوژي، تهران , موسوي حسيني، كامران موسسه عالي آموزشي و پژوهشي طب انتقال خون - مركز تحقيقات انتقال خون - گروه بيوتكنولوژي
كليدواژه :
سايتوكين‌ها , سلول‌هاي بنيادي خون‌ساز , ترومبوپويتين
چكيده فارسي :
زمينه و هدف: پروتيين ترومبوپويتين يك سايتوكين مهم است كه در تنظيم تكثير سلول‌هاي بنيادي‌خون‌ساز و تمايز مگاركاريوسيت‌ها دخيل است. به‌دليل مقدار اندك اين پروتيين در خون، در بسياري از مراكز بيوتكنولوژي اين پروتيين به‌صورت نوتركيب توليد مي‌شود. هدف از اين مطالعه همسانه‌سازي و بيان ژن اين پروتيين بود.
روش بررسي: اين مطالعه تجربي آزمايشگاهي در مركز تحقيقات انتقال خون تهران، از مرداد 1395 تا شهريور 1396 انجام گرفته است. سلول‌هاي رده سلولي HepG2 كشت و از آن‌ها RNA جهت الگوي سنتز cDNA استخراج شد. cDNA به‌عنوان الگوي واكنش PCR با استفاده از پرايمرهاي طراحي شده قرار گرفت و توالي رمزكننده‌ي دُمين (Domain) عملكردي ترومبوپويتين جداسازي و وارد پلاسميد pET32 شد. وكتور نوتركيب با استفاده از روش ختم زنجيره توالي‌يابي و سپس وكتور نوتركيب به سويه‌ي بياني رزتاگامي تلقيح شد. القاي بيان پروتيين با استفاده از مقادير مناسب Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) انجام گرفت. باكتري بيان‌كننده تهيه شده، تحت آزمون وسترن بلات قرار گرفت.
يافته‌ها: با خوانش توالي وكتور نوتركيب، حضور توالي ژن ترومبوپويتين تاييد شد. القاي بيان، ارزيابي پروتيين كل سلول حاكي از بيان پروتيين هدف به‌صورت محلول در فضاي سيتوپلاسمي بود. جايگاه قرارگيري باندهاي مربوط به توالي مورد انتظار در ژل پلي‌آكريل آميد و واكنش انجام گرفته با آنتي‌بادي‌هاي آنتي‌هيستگ در وسترن بلات گوياي درستي بيان پروتيين هدف بود.
نتيجه‌گيري: باكتري رزتاگامي توانايي بيان پروتيين نوتركيب ترومبوپويتين را به‌صورت محلول دارد. با اين روش مي‌توان با استفاده از سيستم پربازده باكتريايي، پروتيين نوتركيبي توليد نمود كه به‌صورت انكلوزيون‌بادي نبوده و مستلزم مراحل بازپردازي نمي‌باشد.
چكيده لاتين :
Background: Thrombopoietin (TPO) is an important cytokine that has a critical role in
regulating hematopoietic stem cells (HSCs) proliferation and megakaryocyte
differentiation. Because of scares amount of this protein in human plasma, in many
biotechnological centers around the world, recombinant production of this protein has
been carried out. This study was aiming to gene cloning and expression of recombinant
thrombopoietin.
Methods: This research is an experimental laboratory study carried out in Blood
Transfusion Research Center, Tehran, Iran, from July 2016 to August 2017. At the
beginning HepG2 cell line was cultured and RNA extraction was performed. Extracted
RNA was used as template for cDNA synthesis and subsequently the synthesized
cDNA was adopted to isolate TPO gene through polymerase chain reaction (PCR)
reaction using designed primers. After isolating the TPO sequence from HepG2 cell
line, the designated sequence was inserted into pET32 vectors. Recombinant plasmid
was amplified by meriting from DH5α replicating system. The amplified plasmids were
sequenced via chain termination method. Next step was transforming the recombinant
plasmid into Rosetta-gami bacteria to express the recombinant protein. In order to
induce protein expression, an appropriate amount of isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG) was added to growth media, then bacterial lysate of
expression host was prepared and assayed via polyacrylamide gel electrophoresis and
western blotting test.
Results: After sequencing of recombinant plasmid, it was confirmed that TPO sequence
has been successfully colonized in adopted vector. Subsequent to induction of
recombinant protein, total cell protein analysis affirmed that recombinant protein has
been expressed in its soluble form at cytoplasmic condition. Location of expected
recombinant protein band on polyacrylamide gel and reaction of recombinant protein
with His-tag monoclonal antibody at western blotting was asserting that expressed
protein is the one of interest.
Conclusion: Rosetta-gami bacteria has capability of expressing recombinant
thrombopoietin in its soluble form. By harnessing this method of recombinant protein
expression, it would be possible to take advantage of high throughout bacterial
expression system which would not produce inclusion body and its product doesn’t
need further processing and refolding.
عنوان نشريه :
مجله دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران
