طراحي و بهينه‌سازي سيستم الايزاي نقطه‌اي (Dot-blot ELISA) با آنتي‌ژن‌هاي اختصاصي براي تشخيص ساده و سريع مشمشه

Design and optimization of Dot-blot ELISA system using specific antigens for simple and rapid diagnosis of glanders

مشمشه از قديمي‌ترين بيماري‌هاي واگير خطرناك و مشترك بين انسان و حيوان است كه با ظهور جراحات گرانولوماتوزي قرحه‌اي در پوست و غشاهاي مخاطي مشخص مي‌شود. با توجه به گزارش حتي يك مورد بيماري و لزوم جلوگيري از انتشار آن با شناسايي و معدوم‌سازي ميزبان‌هاي آلوده، شناسايي زودهنگام بيماري با روش‌هاي حائز حساسيت و ويژگي قابل قبول، از اهميت بالايي برخوردار است. مطالعۀ حاضر به ‌منظور طراحي و بهينه‌سازي سيستم الايزاي نقطه‌اي (Dot-blot ELISA) با آنتي‌ژن‌هاي اختصاصي جهت تشخيص ساده و سريع مشمشه در نمونه‌هاي سرمي اسب‌سانان انجام گرفت. مواد و روش‌ها سويه‌هاي بورخولدريا مالئي در محيط مايع نوترينت همراه با گليسيرول 4 درصد كشت داده شدند. آنتي‌ژن‌هاي كل سلول باكتري با استفاده از روش سونيكاسيون و ترسيب با تري‌كلرو استيك اسيد (TCA) استخراج شد. غلظت بهينه آنتي‌ژن-آنتي‌بادي با روش تيتراسيون چكر بورد معين شد. آنتي‌ژن باكتري روي كاغذ نيتروسلولز مفروش و بعد از متوقف‌سازي با شيرخشك، سرم حيوان مشكوك و سپس آنتي‌بادي كونژوگه شده با HRP اضافه گرديد و با استفاده از سوبستراي TMB، سيگنال‌ها رهگيري شد. يافته‌ها تعداد 4 نمونه از 90 نمونۀ سرم با استفاده از آزمون الايزاي نقطه‌اي، مثبت گزارش شد. ويژگي و حساسيت آزمون، به‌ترتيب 96/62 و 100 درصد برآورد گرديد. كشت و جداسازي بورخولدريا مالئي از نمونه‌هاي باليني حيوان، اعتبار تست را تاييد كرد. نتيجه‌گيري يافته­‌ها نشان داد روش الايزاي نقطه‌اي حائز حساسيت، ويژگي و دقت بالا در تشخيص مشمشه بوده و به‌ دليل سرعت، سهولت تفسير بدون نياز به ابزار خاص، مقرون به‌صرفه بودن و قابليت كاربردي صحرايي آن، روش كاربردي و كارآمد مي­‌باشد.

Glanders is one of the oldest contagious and dangerous zoonotic diseases manifesting ulcerative granulomatous lesions on the skin and mucous membranes. Early methods possessing desirable sensitivity and specificity is important to diagnose the disease considering the just only one case report and preventing disease by identification and eradication. The present study was aimed to design and optimize Dot-blot ELISA system using specific antigens for simple and rapid detection of glanders using equine sera samples. Materials & Methods Burkholderia mallei strains were cultured in nutrient broth supplemented with glycerol 4%. Whole cell antigens of bacterial strains were precipitated by trichloroacetic acid (TCA) followed by sonication method. The optimum concentrations of antigen-antibody were determined by checkerboard titration. The nitrocellulose membrane was coated by antigen, then stopped by skimmed milk as a blocker. The suspicious equine serum was added to the membrane following HRP-conjugated antibody, the signals were detected by TMB as a substrate. Results 4 out of 90 sera samples were positive by Dot-blot ELISA. The specificity and sensitivity of the test were evaluated 96.62% and 100%, respectively. B. mallei culture and isolation from clinical specimens of the horses validated the test. Conclusion Our study showed that the Dot-blot ELISA is specific and sensitive in glanders diagnosis and it seems to be practical and efficient test due to the rapid, easy interpretation without any special tools, cost-effective and also field-friendly.