كلونينگ ناحيه ايمونوژنيك توكسين B كلستريديوم ديفيسيل در لاكتوكوكوس لاكتيس با هدف توسعه واكسن دهاني مبتني بر لاكتوكوكوس عليه كوليت ناشي از كلستريديوم ديفيسيل

Cloning of Immunogenic Domain of Clostridium Difficile Toxin B in Lactococcus lactis to Develop an Oral Vaccine Based on Lactococcus against Clostridium difficile Associated Colitis

مقدمه: باكتري كلستريديوم ديفيسيل عامل ايجاد عفونت بيمارستاني و كوليت غشاي كاذب مي باشد. توكسين B اين باكتري به عنوان يكي از فاكتورهاي اصلي بيماري زايي اين باكتري شناخته شده است. ناحيه اتصالي پذيرنده(RBD) اين توكسين، ناحيه ايمني زاي توكسين شناخته و به گيرنده واقع در روده متصل مي شود. هدف اين مطالعه كلون نمودن و بيان ناحيه ايمني زاي توكسين B در باكتري لاكتوكوكوس لاكتيس به منظور تهيه واكسن دهاني مطمئن و ايمن عليه كوليت ناشي از كلستريديوم ديفيسيل، به عنوان يك روش درماني جايگزين در مطالعات آينده و مبتني بر لاكتوكوكوس مي باشد. مواد و روش ها: ابتدا با استخراج DNA از باكتري كلستريديوم ديفيسيل و با پرايمرهاي طراحي شده، قطعه RBD به روش PCR تكثير شد. قطعه تكثير شده در پلاسميد pTZ57R/T الحاق و در باكتري E.coli ترانسفورم شد. سپس قطعه RBD با برش آنزيمي توسط آنزيم هاي NcoI و SacI، از پلاسميد pTZ57R/T خارج و خالص سازي شد. قطعه RBD در پلاسميد بياني pNZ8149برش خورده با آنزيم‌ هاي مشابه تحت شرايط مناسب الحاق شد. سپس پلاسميد بياني pNZ8149 حاوي قطعه با روش الكتروپوريشن درون سلول هاي مستعد لاكتوكوكوس لاكتيس ترانسفورم شد. يافته هاي پژوهش: پس از غربالگري كلوني هاي ترانسفورم شده، صحت كلونينگ با انجام PCR، هضم آنزيمي بر روي پلاسميد نوتركيب استخراج شده و نهايتاً با تعيين توالي، تاييد شد. بحث و نتيجه گيري: لاكتوكوكوس لاكتيس توليد كننده اين ناحيه ايمني زا مي تواند به منظور تهيه واكسن دهاني مطمئن و ايمن، به عنوان يك روش درماني جايگزين جهت كاهش شيوع عفونت كلستريديوم ديفيسيل در مطالعات آينده مورد استفاده قرار گيرد.

Introduction: Clostridium difficile bacterium is the leading cause of clinical infection and pseudomembranous colitis. Toxin B (TcdB) of C. difficile is regarded as one of the main virulence factors of this bacterium. Moreover, the receptor binding domain (RBD) of this toxin which is known as an immunogenic domain attaches to its receptor in intestine. This study aimed to clone and express the immunogenic domain of the Toxin B in Lactococcus lactis to provide a safe oral vaccine against colitis caused by C. difficile as an alternative treatment in future studies based on Lactococcus. Materials & Methods: In order to clone this segment, at first, the DNA was extracted from C. difficile, and then, the RBD gene segment was amplified by the PCR method using designed primers. The amplified segment was attached to pTZ25R/T plasmid and transformed into Escherichia coli. Subsequently, the RBD segment was extracted from pNZ9418 plasmid using restriction enzymes, such as SacI and NcoI, and then it was purified in this study. Following that, the RBD segment was cut in pNZ8149 plasmid using the same enzymes and was attached under the proper condition. The pNZ8149 plasmid with segment was transformed into L. lactic competent cells by electroporation method. Findings: After the screening of electro-transformed colonies, the accuracy of cloning was verified using PCR, enzyme digestion on the extracted recombinant plasmid, and sequencing. Discussion & Conclusions: According to the results, L. lactic which produces the immunogenic domain can be used as a safe oral vaccine and can be considered as an alternative therapy to reduce the incidence of Clostridium difficile infection in further investigations.