زير همسانه سازي و بيان آنتي ژن كايمر C-CFTX1-STxB زهر عروس دريايي و بررسي آنتي ژنيسيتي آن در موش سوري

Subcloning and Expression of the Chimeric Antigen C-CFTX1-STxB of the Jellyfish Venom and its Antigenicity Assessment in Syrian Mice

مقدمه: گزش عروس ­دريايي جعبه ­اي دردناك بوده و مي­ تواند مهلك باشد. زهر گونه C. fleckeri حاوي انواع پروتئين ­هاي فعال زيستي است. دو مورد از فراوان ­ترين پروتئين ­هاي موجود در اين گونه، CfTX-1 و CfTX-2 است كه با استفاده از روش الكتروفورز يا كروماتوگرافي به راحتي قابل جداسازي نمي باشند. فناوري بيان نوتركيب، جايگزيني مناسب براي جداسازي پروتئين طبيعي زهر مي باشد. هدف از اين مطالعه، بيان پروتئين C-CfTX1-STxB در E.coli و بررسي آنتي ژنيسيتي آن در موش سوري مي باشد. مواد و روش ها: ژن كامل CfTX1 صناعي در پلاسميد pUC57 تهيه شد. قطعه CfTX-1 C- به وسيلهPCR تكثير و با جايگاه هاي آنزيمي BamHI وSalI در وكتور بياني pET28a-stxB زير همسانه ­سازي و به باكتري E.coli ترانسفورم شد. بيان ژن تحت القايIPTG انجام گرديد. پس از تخليص پروتئين و تزريق به موش سوري، ميزان آنتي بادي توليد شده در سرم اندازه گيري شد. هم چنين موش ها به وسيله زهر عروس دريايي Rhopilema nomadica چالش شدند. يافته هاي پژوهش: در اين مطالعه تجربي، ژن C-CfTX1-STxB، كلون شده در وكـــتور بياني pET28a(+) به وسيله PCR، توالي يابي و با آناليز آنزيمي تاييد گرديد. هم چنين پروتئين نوتركيب توليد شده به وسيله وسترن تاييد شد. آنتي بادي توليد شده در سرم، توسط تست الايزا كميت سنجي شد. بحث و نتيجه گيري: موش ­هاي ايمن شده در چالشي پس از 60 روز، 50 برابر LD50 زهر عروس دريايي را تحمل مي نمايند. با توجه به عدم خاصيت كارديوتوكسيستي و نوروتوكسيستي پروتئين نوتركيب، اين پروتئين توليد شده مي تواند به عنوان كانديد واكسن زهر عروس دريايي در موش سوري يا در مراحل بعدي كارآزمايي باليني براي انسان پيشنهاد شود.

Introduction: Box jellyfish stings are painful and may be life-threatening. The venom of Chironex fleckeri contains a variety of bioactive proteins as well as two of the most abundant proteins, namely CfTX-1 and CfTX-2 which cannot be isolated easily using electrophoresis or chromatography techniques. Recombinant expression technology may offer an alternative to the isolation of native C.fleckeri venom protein. This study aimed at expressing C-CfTX1-STxB protein in Escherichia coli and assessing its antigenicity in Syrian mice. Materials & Methods: Synthesis of the artificial CfTX1complete gene was prepared in plasmid pUC57. The C-cftx1 was cloned using a polymerase chain reaction (PCR) and subcloned with BamHI and SalI restriction enzyme sites in pET28a-stxB expression vector and transformed into E.coli. Gene expression was artificially induced by Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside. After the purification of the protein and its injection into the Syrian mice, the amount of produced antibody was measured in the serum. The rats were also challenged by the venom of the jellyfish (i.e., Rhopilema nomadic). Findings: In this experimental study, the C-CfTX1-STxB gene was cloned in the expression vector pET28a (+), sequenced by PCR, and analyzed by enzymatic analysis. Moreover, the produced recombinant protein was confirmed by Western blotting. The produced antibody in the serum was quantified using an enzyme-linked immunosorbent assay. Discussion & Conclusions: After 60 days, the immunized mice tolerated 50x LD50 of jellyfish venom. Considering the ineffectiveness of cardiotoxicity and neurotoxicity of the recombinant protein, this produced protein can be suggested as a jellyfish venom vaccine candidate in Syrian mice or at a later stage of a clinical trial in humans.