همسانه سازي، بررسي بيان و تخليص ژن كد كننده پروتئين نوتركيب متشكل از زيرواحدهاي اتصالي آنتي‌ژن‌هاي سطحي CS1 و CS2 از اشرشيا‌‌ كلي انتروتوكسيژنيك (ETEC)

Cloning and evaluation of gene expression and purification of gene encoding recombinant protein containing binding subunit of coli surface antigens CS1 and CS2 from Enterotoxigenic Escherichia coli

زمينه و هدف: باكتري اشرشيا كلي انتروتوكسيژنيك از عوامل شايع اسهال است. فاكتورهاي كلونيزاسيون و انتروتوكسين‌ها از عوامل اصلي حدت زا در اين ارگانيسم هستند. باكتري مذكور از طريق فاكتورهاي كلونيزاسيون به سطح سلول‌هاي اپيتليال روده متصل مي‌شود و انتروتوكسين‌ها را توليد مي‌كند كه اين سموم باعث ترشح بيش‌ازحد مايعات و الكتروليت‌ها در لومن روده مي‌شوند كه درنهايت منجر به اسهال مي‌گردند. به دليل درمان مشكل و شيوع بالاي اين بيماري طراحي واكسن عليه اين ارگانيسم يكي از اهداف سازمان بهداشت جهاني است. پروتئين CooD – CotD به‌عنوان زير واحدهاي رأسي CS1 و CS2 نقش مهمي را در اتصال باكتري به سلول‌هاي اپيتليال روده ايفا مي‌كنند. در اين مطالعه بيان و تخليص ژن كد كننده پروتئين كايمريك CooD – CotD به‌عنوان كانديداي واكسن‌هاي زيرواحدي انجام شد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه‌، بهينه‌سازي كدوني ژن كايمريك cooD – cotD با نرم‌افزار Gene Designer انجام شد. ژن موردنظر با روش PCR تكثير و در وكتور كلونينگpJET1.2/blunt همسانه سازي گرديد و به‌منظور بيان در وكتور بيانيpET28a زيرهمسانه‌سازي شد. پروتئين با روش كروماتوگرافي نيكل تخليص و با وسترن بلات ارزيابي شد. نتايج: حضور باند 82 كيلودالتوني در ژل SDS-PAGE 10 درصد بيان پروتئين كايمريك CooD – CotD را نشان داد كه با روش وسترن بلات تأييد گرديد. ميزان پروتئين تخليص شده در اين تحقيق 121 ميكروگرم در ميلي‌ليتر بود. نتيجه‌گيري: مطالعات بيان و تخليص پروتئين نشان داد كه اين پروتئين داراي بيان در ميزبان همولوگ است.

Background & Objective: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is a major causative agent of diarrhea. Enterotoxins and the colonization factors (CFs) are major virulence factors in ETEC infections. The bacterium binds to the intestinal epithelial cell surface through colonization factors and produces enterotoxins that cause excessive fluid and electrolyte secretion in the lumen of the intestine, which ultimately leads to diarrhea. Due to the difficult of treatment and the high prevalence of this disease, the design of the vaccine against this organism is one of the goals of the World Health Organization. The CooD-CotD protein, as adhesion tip subunits of CS1 and CS2, plays an important role in bacterial attachment to the intestinal epithelial cells. In this study, the expression and purification of chimeric protein CooD-CotD was carried out with the aim of investigating as candidate vaccine. Materials & Methods: In this study, codon optimization of cooD-cotD chimeric gene was performed by Gene Designer software. The gene was amplified by PCR and cloned into pJET1.2 / blunt then it was subcloned into pET28a to express chimeric protein. Recombinant protein was purified following expression, using Ni-NTA affinity chromatography and confirmed by western blotting analysis. Results: The presence of 82kDa in the SDS-PAGE gel showed that expression of CooD-CotD chimeric protein and confirmed by western blotting analysis. Yield of purified protein was 121 mg/ml. Conclusions: Expression and protein purification studies showed that this protein has expression in the homologous host.