افزايش قدرت كاتاليتيكي آنزيم فلاوين ردوكتاز DszD با استفاده از روش جهش زايي هدفمند در باكتري رودوكوكوس اريتروپوليس

Increasing the Catalytic Power of the Flavin Reductase DszD Enzyme Using Site-Directed Mutagenesis Method in Rhodococcus Erythropolis

زمينه و هدف آنزيم فلاوين ردوكتاز DszD به عنوان آنزيم كليدي جهت تأمين نيروي احيايي لازم در فرايند گوگردزدايي باكتريايي محسوب مي‌شود. با توجه به اينكه سرعت فرايند گوگردزدايي به دليل پايين‌بودن قدرت كاتاليتيكي اين آنزيم پايين است، بنابراين به منظور بهره‌گيري از آن به عنوان كاتاليزور زيستي تجاري، افزايش قدرت كاتاليتيكي آنزيمي ضروري است. مواد و روش ها ساختار سه‌بعدي آنزيم فلاوين ردوكتاز DszD توسط سرور CPH-Model، پيش‌گويي و توالي آمينو اسيد آن در پايگاه اطلاعات پروتئيني به منظور شناسايي مولكول‌هاي همولوگ جست‌وجو شد. بر اساس هم‌ترازي توالي آمينو اسيدهاي آن با مولكول‌هاي همولوگ، باقي‌مانده‌هاي كليدي در اتصال با سوبستراي فلاوين مونونوكلئوتيد (FMN) شناسايي شد. باقي‌مانده كليدي آسپارژين در موقعيت 77 با استفاده از روش جهش‌زايي هدفمند با فنيل ­آلانين جايگزين شد. ملاحظات اخلاقي اين مطالعه با كد IR.NIGEB.EC.1398.6.24 A به تأييد كميته اخلاق پژوهشي پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست‌فناوري رسيده است. يافته‌ها همسانه‌سازي و بيان هريك از ژن‌هاي وحشي و جهش‌يافته به طور جداگانه انجام و قدرت كاتاليتيكي آنزيم‌هاي وحشي و جهش‌يافته توليدي با يكديگر مقايسه شد. نتايج سنجش فعاليت آنزيمي نشان داد قدرت كاتاليتيكي آنزيم جهش‌يافته نسبت به آنزيم وحشي به ميزان 2/5 برابر افزايش يافته است. نتيجه گيري جايگزين‌كردن آمينو اسيد فنيل آلانين به جاي آمينو اسيد آسپارژين در موقعيت 77 منجر به افزايش قدرت كاتاليتيكي آنزيمي در راستاي افزايش سرعت فرايند گوگردزدايي مي‌شود.

Background and Aim The flavin reductase DszD enzyme is a key enzyme for providing required reduction potential in the bacterial desulfurization process. Considering the low speed of desulfurization process because of low catalytic power of this enzyme, it is necessary to increase the catalytic power of flavin reductase for industrial use of this enzyme as biocatalyst. Methods & Materials The three-dimensional structure of the flavin reductase DszD enzyme was predicted by a CPHmodel server and its amino acid sequence was searched in the protein data bank to identify the homologue molecules. Based on the alignment of the amino acid sequence and the model molecules, the key residues at the flavin mononucleotide substrate were identified. The key residue of asparagine at position 77 was replaced with phenylalanine using the site-directed mutagenesis method. Ethical Considerations This study with research ethics code IR.NIGEB.EC.1398.6.24 A has been approved by research ethics committee at National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran. Results The cloning and expression of each of the wild-type and mutant genes were performed separately. The catalytic power of the produced wild-type and mutant enzymes were compared. The catalytic activity measurements showed that the mutant enzyme had a 2.5 fold increase in catalytic power. Conclusion Replacing phenylalanine with asparagine at position 77 of flavin reductase DszD enzyme leads to an increase in enzyme catalytic power to increase the speed of bacterial desulfurization process.