شناسايي باكتري‌هاي موجود در صفراي بيماران مبتلا به مشكلات صفراوي و بررسي توليد بيوفيلم در جدايه‌هاي شايع

Determination of bacteria in gallbladder of patients with cholelithiasis and evaluation of pathogenic factors of the prevalent isolated bacteria

زمينه و هدف: عفونت‌هاي مختلف در سيستم مجاري صفراوي و تشكيل سنگ از عوامل انسداد جريان صفرا در آن ارگان استريل است. اين مطالعه به منظور شناسايي باكتري‌هاي موجود در صفراي بيماران مبتلا به مشكلات صفراوي و بررسي توليد بيوفيلم در جدايه‌هاي شايع انجام شد. روش بررسي: اين مطالعه توصيفي آزمايشگاهي روي 35 نمونه (سنگ و بافت صفرا) جمع‌آوري شده در شرايط استريل (به روش لاپاراسكوپي) از بخش جراحي بيمارستان امام‌ خميني تهران طي شش‌ماه اول سال 1395 انجام شد. نوع سنگ‌ها به‌كمك روش‌هاي شيميايي و نوع ميكروب‌ها با استفاده از آزمايشات بيوشيميايي و مولكولي تعيين شدند. براي جستجوي باكتري‌ها در نمونه‌هاي منفي، DNA از بافت كيسه صفرا تخليص شد و با استفاده از پرايمرهاي 1492R وF 27 براي تكثير قطعه‌اي از ژن 16SrRNA الگو قرار گرفت. نوع باكتري در نمونه‌هاي مثبت به‌كمك بانك اطلاعاتي NCBI تعيين شد. شايع‌ترين جدايه از لحاظ شدت توليد بيوفيلم به‌كمك روش ميكرو تيترپليت و ژن‌هاي درگير اين فنوتيپ Ag43(Flu) و CsgF به‌روش PCR مورد بررسي قرار گرفت. مقاومت آنتي‌بيوتيكي آنها با استفاده از روش ديسك ديفيوژن تعيين گرديد. يافته‌ها: تعداد 13 نمونه داراي انواع باكتري شامل 3 جدايه كلبسيلا، 4 جدايه اشريشيا كلي، يك جدايه انتروباكتر، 2 جدايه استافيلوكوكوس اورئوس، 2 جدايه انتروكوك و يك جدايه استرپتوكوكوس بودند. از 23 مورد نمونه صفرا، در 65.7% موارد بااستفاده از روش كشت ميكروبيولوژيك، باكتري جدا نگرديد؛ ولي هفت باكتري شامل شش سويه كلبسيلا و يك انتروكوك با استفاده از تكثير 16SrRNA و تعيين ترادف شناسايي شدند. بنابراين، در مجموع گونه كلبسيلا (47.36%) بيشترين سهم را در عفونت‌هاي كيسه صفرا نشان داد. تركيبات كلسترولي و بيلي‌روبيني در 98درصد نمونه‌هاي حاوي سنگ ديده شد. با وجود آن كه وفور كلبسيلا در عفونت‌هاي كيسه صفرا (47.36%) بيش از بقيه باكتري‌ها بود. بيشترين باكتري قابل كشت اشريشيا كلي بود. كليه اشريشيا كلي‌هاي مورد بررسي داراي ژن‌هاي عامل ايجاد بيوفيلم بودند؛ ولي شدت تشكيل بيوفيلم در دو مورد از آنها قوي و در دو مورد ديگر متوسط بود. اين باكتري‌ها نسبت به اكثر آنتي‌بيوتيك‌ها حساس بودند و به تتراسيكلين، سيپروفلوكسازين و سفتي زيديم مقاومت‌هاي متفاوتي را نشان دادند و به تتراسيكلين مقاوم‌تر بودند. نتيجه‌گيري: باكتري‌هاي غيرقابل كشت سهم مهمي در عفونت‌هاي كيسه صفرا دارند. توانايي بالاي ايجاد بيوفيلم در باكتري‌هاي شايع جداشده هشداري براي مداقه در تجويز آنتي‌بيوتيك‌ها براي از بين بردن اين بيوفيلم‌هاي عفوني در عفونت‌هاي كيسه صفرا را نشان مي‌دهد.

Background and Objective: Various infections and the formation of stones could be the cause for bile duct obstruction of that sterile organ. Determination of pathogenesis factors and the bacteria involved in infections are important in the prevention of disease, and cares needed following surgery. This study was done to determine the bacteria in the gallbladder of patients with cholelithiasis and evaluation of pathogenic factors of the prevalent isolated bacteria. Methods: In this descriptive laboratory study, 35 samples of gallbladder tissues which contained gallstones were collected under sterile conditions in “Department of General Surgery of Imam Khomeini Hospital”, Tehran, Iran during 2016. The stone types were analyzed and decomposed by chemical procedures, and the bacteria existed in the tissues were also identified using biochemical experiments. The tissues with negative results in microbiological studies were looked for any contaminating bacteria, applying the DNA extracted from gallbladder tissue as a template using F27 and R1492 as the primers for PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification of 16SrRNA gene. Those with the positive results of microbiological tests were subjected to the DNA sequencing following gel purification and blasted against the NCBI gene database. The most frequently isolated bacteria were studied according to the intensity of biofilm formation, using the microtitre plate method. CsgF and Ag43 (Flu), the genes involved in the induction of such phenotype were also analyzed in this study. The antibiotic resistance assay of the isolates was performed using disc diffusion procedure. Results: Thirteen out of thirty five samples of post-surgery gallbladder tissues were found to be infected by different bacteria, including: Klebsiella (3 cases), Escherichia coli (4 cases), Enterobacter (1 case), Staphylococcus aureus (2 cases), Enterococci (2 cases), and Streptococcus (1 case). In 23 out of 35 samples (65.7%), no bacteria could be isolated using microbiological methods. However, in seven out of 23 samples, the amplified 16SrRNA had an indication of Klebsiella (6 cases) and Enterococcus (1 case) isolates. Therefore, the most prevalent genus in gallbladder infections was Klebsiella (47.36%). Chemical analysis showed that the highly frequent compound of gallstones (98%) were of cholesterol and bilirubin. Escherichia coli with fourcases were the highest culture growing isolated bacteria, in all of which, the biofilm formation genes were present. In the two out of four Escherichia coli isolates the intensity of biofilm formation was high. Although, in the remaining two isolates was medium. While, they were found to be sensitive to the most of the antibiotics, they showed resistance to Tetracycline, Ciprofloxacin and Ceftazidime in different ranges. Conclusion: The present study provided evidence that non-cultural bacteria are hihly present in gallbladder infections. The high potential of the commonly isolated bacteria in biofilm formation should be taken as a warning to follow the precise protocol of antibiotic prescription for treatment of gallbladder infections.