ساخت پلاسميد نوتركيب بيان كننده ژن AID تحت كنترل پروموتر حساس به حرارت باكتريوفاژ لامبدا

Construction of the Recombinant Plasmid Expressing AID under the Control of Temperature-sensitive Promoter of Bacteriophage Lambda

سابقه و هدف: آنزيم Activation-induced cytidine deaminase (AID) يك آنزيم اختصاصي لنفوسيت‌هايB در هايپرموتاسيون سوماتيك و نوتركيبي تعويض كلاس ژن‌هاي آنتي‌بادي در فوليكول هاي لنفوسيت B ارگان هاي لنفاوي محيطي مي‌باشد. بيان نا به جاي اين آنزيم منجر به موتاسيون در سلول‌هاي غير از لنفوسيت‌هاي B و حتي در باكتري Escherichia coli شده است. با اين وجود، القاي موتاسيون در باكتري Escherichia coli توسط بيان آنزيم AID، نيازمند بهينه سازي شرايط مطلوب و كنترل شده مي باشد. بنابراين هدف اين مطالعه توليد يك پلاسميد بياني AID تحت كنترل پروموتر حساس به حرارت از باكتريوفاژ لامبدا مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در مرحله اول، جداسازي ژن AID از پلاسميد نوتركيب PGEMT حاوي AID انجام شد. ژن تخليص شده در پلاسميد PTG19-T در باكتري E.coli سوش Top10 كلون شد و سپس در يك پلاسميد بياني القايي با دما حاوي پروموتر چپ باكتريوفاژ لامبدا و رپرسور حساس به حرارت cI857 منتقل و در باكتري E.coli قرار داده شد. در مرحله آخر، ژن مقاومت به تتراسايكلين جايگزين ژن مقاومت اين پلاسميد نوتركيب شد. يافته‌ها: ژن AID در پلاسميد حاوي رپرسور حساس به حرارت cI857 از باكتريوفاژ لامبدا انتقال يافت. صحت توالي و چارچوب خوانش توسط الكتروفورز محصولPCR، استفاده از روش‌هاي هضم آنزيمي وهمچنين تعيين توالي ژنAID، تاييد شد. استنتاج: ژن AID به‌طور موفقيت‌آميزي در پلاسميد حاوي پروموتر حساس به حرارت از باكتريوفاژ لامبدا كلون شد. اين پلاسميد نوتركيب مي تواند در سويه هاي مختلف باكتريE.coli جهت توليد سويه هاي mutator استفاده شود.

Background and purpose: Activation-induced cytidine deaminase (AID) is a B-cell specific enzyme responsible for somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) of antibody genes within the B-cell follicle of peripheral lymphoid organs. Ectopic overexpression of the enzyme leads to mutations in non-B cells and Escherichia coli (E.coli) genes. However, induction of mutations in E.coli by expression of AID requires highly regulated conditions. Therefore, the aim of this study was to construct a plasmid expressing AID under the control of tightly regulated temperature-sensitive promoter of bacteriophage lambda.. Materials and methods: The AID gene was isolated from PGEMT recombinant plasmid, containing AID and cloned into PTG19-T vector. Then, AID was ligated to an expression plasmid under the control of left promoter of bacteriophage lambda and mutant thermolabile cI857 repressor. Finally, the resistance marker of the engineered plasmid was replaced by tetracycline resistance gene. Results: The whole open reading frame of AID was ligated into a plasmid containing a cI857-sensitive receptor lambda bacteriophage. The sequence and reading frame accuracy of the cloning was confirmed by electrophoresis of PCR products on agarose gel, restriction enzyme digestion, and nucleotide sequencing methods. Conclusion: In current study, the AID was successfully cloned into an expression plasmid containing thermo-sensitive promoter of bacteriophage lambda. The recombinant plasmid could be used in different strains of E.coli to produce mutator strains.