بررسي بيان و فعاليت ضد‌ميكروبي پپتيد‌هاي نوتركيب درماسپتين B1 در گياهان تراريخت توتون

Expression and antimicrobial activity analysis of dermaseptin B1 recombinant peptides in tobacco transgenic plants

اخيراً، روش‌هاي جديد به‌نژادي مولكولي و مهندسي‌ژنتيك براي غلبه بر محدويت‌هاي به‌نژادي سنتي در ايجاد گياهان مقاوم به بيماري به‌وجود آمده‌اند. استفاده از پپتيد‌هاي ضد‌ميكروبي در توليد گياهان تراريخت مقاوم به طيف گسترده‌اي از بيمارگر‌هاي گياهي با موفقيت‌هاي فراواني همراه بوده است. در ميان تعداد زيادي از پپتيد‌هاي ضد‌ميكروبي، درماسپتين B1 يك پپتيد ضد‌‌ميكروبي كاتيوني به‌طول 31 اسيد آمينه با خاصيت ضد‌ميكروبي عليه طيف وسيعي از بيمارگر‌هاي بيماري‌زا مي‌باشد. با هدف افزايش كارايي ضد‌ميكروبي اين پپتيد، توالي كد‌كننده‌ي پپتيد ضد‌ميكروبي DrsB1 يك بار به انتهاي N و بار ديگر به انتهاي C توالي كد‌كننده‌ي دمين اتصال به كيتين ژن Avr4 قارچ كلادوسپوريوم فلاوم (Cladosporium fulvum) متصل و سامانه‌هاي ژني (CBD-DrsB1 and DrsB1-CBD) به كمك روش اگروباكتري به ريزنمونه‌هاي برگي گياه توتون منتقل گرديدند. با استفاده از واكنش‌هاي PCR، RT-PCR و SDS-PAGE به‌ترتيب حضور ترانسژن‌ها و بيان آن‌ها در گياهان تراريخت توتون تأييد شد. فعاليت ضد‌ميكروبي پپتيد‌هاي نوتركيب استخراج شده عليه تعدادي از بيمارگر‌هاي گياهي و انساني مورد بررسي قرار گرفت. دو پپتيد نوتركيب داراي اثرات بازدارندگي معني‌داري (P ≤ 0.01) روي رشد و نمو قارچ‌هاي بيماري‌زا بودند. همچنين نتايج حاصل از آزمايش CFU نشان داد كه پپتيد‌هاي نوتركيب توليدي گياهان تراريخت، اثر ممانعت‌كننده نسبتا بالاي روي اين بيمارگر‌ها داشتند. پپتيد نوتركيب CBD-DrsB1 داراي بيشترين اثر ضد‌باكتريايي، در حالي‌كه پروتئين نوتركيب DrsB1-CBD از توانايي ضد‌قارچي بالاتري برخوردار بود. علاوه بر اين، بيان پپتيد نوتركيب DrsB1-CBD سبب افزايش مقاومت معني‌داري عليه قارچ R.solani در مقايسه با قارچ .Pythium sp گرديد. جالب توجه آن‌كه، قارچ‌هايي با مقدار بيشتري از كيتين در ديواره سلولي نسبت به پپتيد‌هاي نوتركيب آسيب‌پذير‌تر بودند كه اين مسئله نشان مي‌دهد پپتيد‌هاي نوتركيب داراي تمايل بيشتري به كيتين ديواره سلولي هستند. به‌دليل فعاليت ضد‌ميكروبي بالا و جديد بودن پپتيد‌هاي نوتركيب، مي‌توان از اين راهكار براي اولين بار، براي توليد ارقام مقاوم تراريخت محصولات زراعي عليه بيمارگر‌ها استفاده نمود.

Recently, new molecular breeding and genetic engineering approaches have emerged to overcome the limitations of conventional breeding methods in generating disease-resistance transgenic plants. The use of antimicrobial peptides (AMPs) to produce transgenic plants resistant to a wide range of plant pathogens has achieved great success. Among huge number of AMPs, Dermaseptin B1 (DrsB1), an antimicrobial cationic 31 amino acids peptide, exhibits significant antimicrobial activities towards a wide range of pathogens. In order to increase the antimicrobial efficacy of DrsB1, the DrsB1 encoding DNA sequence was either fused to the N- or C-terminus of the sequence encoding chitin-binding domain (CBD) of Avr4 gene from Cladosporium fulvum and constructs (CBD-DrsB1 and DrsB1-CBD) were used for tobacco leaf disk Agrobacterium-mediated transformation. Polymerase chain reaction (PCR), semi-quantitative RT-PCR and SDS-PAGE analysis indicated the integration of transgenes in tobacco genome and expression of the recombinant genes in transgenic plants, respectively. The antimicrobial activity of extracted recombinant peptides were assessed against a number of plant and human pathogens. Both recombinant peptides had statistically significant (P<0.01) inhibitory effects on the growth and development of fungi pathogens. Also, CFU test result showed that extracted recombinant peptides from transgenic plants, had a relatively high inhibitory effect on plant pathogens. The CBD-DrsB1 recombinant peptide demonstrated a higher antibacterial activity, whereas the DrsB1-CBD recombinant peptide performed a greater antifungal activity. In addition, the expression of DrsB1-CBD recombinant peptide significantly inhibited R.solani fungal infection in comparison with Pythium sp. interestingly, fungi with a higher amount of cell wall chitin were more vulnerable to recombinant peptides, suggesting recombinant peptides present a higher affinity for cell wall chitin. Owing to the high antimicrobial activity and novelty of recombinant peptides, this strategy for the first time, could be used to generate transgenic crop plants resistant to devastating plant pathogens.