طراحي و ساخت ناقل بياني گياهي واجد ژن نشانگر مقاومت به آنتي‌بيوتيك هيگرومايسين

ناقلين دوتايي مرسوم مبتني بر pBI121 كه هنوز به طور گسترده‌اي در انتقال ژن به گياه به‌وسيله آگروباكتريوم استفاده مي‌شوند،‌ به‌علت عدم كارآيي گزينش‌گر كانامايسين، در برخي از گياهان تك‌لپه‌اي‌ قابل استفاده نيستند در حالي كه مقاومت به هيگرومايسين يك نشانگر گزينشي پركاربرد و مهم در تراريختي برخي گياهان به‌ويژه تك‌لپه‌اي‌ها به شمار مي‌رود. از اين رو در مطالعه حاضر، بهبود ناقل‌ pBI121 براي تراريختي گياهان تك‌لپه‌اي مورد نظر قرار گرفت. به اين منظور، ژن مقاومت به هيگرومايسين به همراه خاتمه‌دهنده 35S از پلاسميد p6-ubi-rnai به‌وسيله آنزيم‌هاي برشي SmaІ‌ و NotІ، جداسازي و در ناقل حدواسط pBlueScript همسانه‌سازي شد. در ادامه، با استفاده از آنزيم‌هاي HindIII و SmaI، پيش‌بر CaMV 35S از بدنه حامل pBI121 جداسازي و در بالادست اين ژن در ناقل pBlueScript قرار داده شد. با استفاده از آنزيم‌هاي HindIII و Eco53KI، كاست كامل ژن مقاومت به هيگرومايسين جايگزين كاست ژن مقاومت به كانامايسين (كه با استفاده از آنزيم‌هاي HindIII و MssI حذف شده بود) در ناقل pBI121 شد. صحت ساخت ناقل جديد توسط روش PCR، بررسي الگوي هضم آنزيمي و توالي‌يابي تأييد شد. با توجه به محبوبيت سري ناقلين مبتني بر pBI121 نسبت به ساير ناقلين موجود و آشنايي محققين با نحوه دستورزي آنها، كارايي ناقل معرفي شده در اين مطالعه مي‌تواند در پژوهش‌هاي انتقال ژن به گياهان تك‌لپه مورد بررسي قرار گيرد.

Conventional pBI121-based binary vectors are widely used in transformation of higher plants mediated by Agrobacterium but they are useless in transformation of some monocots because of inefficiency of kanamycin in selection, while, hygromycin resistance gene is an important selectable marker that usually used in transformation of several plants, especially monocots. The aim of this study was to improve the pBI121 vector for transformation of monocot plants. For this purpose, the hygromycin resistance gene with the 35S terminator were isolated from p6-ubi-rnai plasmid and cloned into pBlueScript intermediate vector via SmaІ and NotI restriction enzyme digestion. The CaMV 35 promoter was isolated from pBI121 vector by using SmaI and HindIII enzymes and cloned upstream of the gene. By using HindIII and Eco53KI enzymes, the complete hygromycin resistance gene cassette was replaced the kanamycin resistance gene cassette (which digested by HindIII and MssI) of pBI121 vector. Construction of this vector was confirmed by PCR method, digestion pattern analysis, and sequencing. Due to the popularity of pBI121-based vectors than other binary vectors and the researchers' familiarity with their manipulation, the vector which is introduced in this study could be used in gene transfer studies of monocot plants.