مهندسي فيتاز اشرشيا كلي به منظور پايدارسازي حرارتي

Engineering of Escherichia coli phytase enzyme thermostability

فيتازها آنزيم هايي هستند كه اسيد فيتيك دانه هاي گياهي را هيدروليز و فسفات را براي حيوانات قابل دسترس مي كنند . اين امر باعث مي شود تا فيتاز به عنوان افزودني جيره غذايي دام، طيور و ماهيان كاربري فراواني داشته باشد. افزودن فيتاز به جيره غذايي باعث حفاظت محيط زيست و ممانعت از اثرات زيان بار افزودن فسفر معدني و پديده Eutrophication مي شود. كاربري وسيع فيتاز در علوم كشاورزي، دامداري و داروسازي نشان از اهميت توليد طبيعي و نوتركيب فيتاز است. از آنجائي كه افزودني جيره غذايي تحت دماي 70 تا 80 درجه سانتي گراد مرحلهFood Pelleting قرار مي گيرد، لذا دستيابي به فيتاز پايدار در برابر حرارت هدف ايده ال است كه با استفاده از روش هاي مهندسي پروتئين مي توان به اين هدف دست يافت. در اين تحقيق پس از بررسي هاي بيوانفورماتيكي، ژن فيتاز سنتتيكBac phy-Wild مطابق ترجيح كدوني ميزبان طراحي و درون باكتري ميزبان Escherichia coli-DH5α كلون سازي شد. جهش زايي هدفمند با هدف افزايش پيوند هاي هيدروفوبي در جايگاه (S392W) انجام شد. ژن طبيعي و جهش يافته Bac Phy-Mut به ناقل بياني pET26b(+) انتقال يافته و سازه حاصل به درون Escherichia coli-BL21 منتقل شد. نتايج الكتروفروز عمودي حضور خارج سلولي فيتاز با وزن مولكولي 42 كيلو دالتون را نشان داد. هم چنين بررسي خصوصيات فيزيكوشيميايي فيتاز هاي نوتركيب نشان داد كه دماي بهينه 55 درجه سانتي گراد و pH بهينه 5 مي باشد. مقايسه پايداري دمايي نمونه جهش يافته نسبت به نمونه طبيعي در دماهاي40، 50، 60، 70 و 80 درجه سانتي گراد به ترتيب 18 ،24، 19، 9 و 6 درصد بهبود را نشان داد. نتايج مطالعه نشان داد كه با استفاده از روش جهش زايي هدفمند مي توان از فيتاز جهش يافته پايدار در برابر حرارت با كاربري در صنايع كشاورزي، دامپروري و محيط زيست به عنوان افزودني جيره غذايي دام، طيور و ماهيان و هم چنين مصارف دارويي بهره برد.

Phytases are enzymes that hydrolysis phytic acid and makes mineral phosphorus available to animals. Natural and recombinant production of this enzyme is one of the important issues in protein engineering field. In this study, the synthetic Phytase gene Bac phy-wild was cloned into PUC57 vector and transformed to susceptible Escherichia coli-DH5α. In order to replace the polar amino acid with non-polar amino acid within the target mutagenic protein; we used a primer designed to tryptophan (S392W) for targeted mutagenicity in the amino acid serine 392 position. After confirming the mutation at the target site, the mutated gene was registered at the NCBI gene bank. To investigate the expression and temperature stability of the mutant enzyme and compare it to WT phytase, the WT and mutated Bac Phy-Mut genes were transferred to pET26b (+) expression vector. Recombinant vector construct was transferred to a to Escherichia coli-BL21. After screening of recombinant clones, SDS-PAGE analysis and protein concentration were used to evaluate the expression of recombinant protein. The results showed the presence of protein with a molecular weight of 42 kDa. Also the study of physicochemical properties of WT and mutated phytase showed that the optimum temperature was unchanged at 55 ° C and the pH was optimized to be 5. Comparison of thermal stability of the mutated phytase in compare with WT at 40, 50, 60, 70 and 80 ° C was improved by 18, 24, 19, 9 and 6%, respectively. Hence, the results of the current research showed that by using targeted mutagenesis method we succeed to improve the mutated phytase with higher thermal stability which could be obtained and mutant phytase could be used in the agricultural and environmental industries as food and feed additive of livestock, poultry and Fish as well as in medical application.