تاثير جهش در جايگاه 330 آنزيم لوسيفراز بر ساختار و عملكرد

Impact of Mutation at Position 330 of Luciferase on the Structure and Function

لوسيفراز حشره شب‌تاب P. py يك آنزيم پراكسيزومي است كه موجب تبديل سوبستراي هتروسيكليك لوسيفرين به يك حدواسط اكسي‌لوسيفرين در حضور Mg+2–ATP و اكسيژن مولكولي مي‌شود. اكسي‌لوسيفرين برانگيخته با نشر نور مريي به حالت پايه مي‌رسد. لومينسانس به دلايل متعددي از جمله سرعت سنجش، حساسيت بالا و آسان‌بودن روش كار، كاربرد وسيعي دارد. برخلاف كاربرد متعدد، لوسيفراز در برابر تغييرات فيزيكي و شيميايي بسيار حساس است بنابراين حساسيت و دقت آن كاهش مي‌يابد. لوسيفراز در برابر دماهاي بالا و هضم پروتئوليتيكي بسيار ناپايدار است. براساس مطالعات قبلي، با پروتئوليز محدود اين آنزيم توسط تريپسين، شش جايگاه برش در دو ناحيه سطحي پروتئين واقع در دمين انتهاي N شناسايي شد 220-206 (شامل K206، R213 و R218) و 341-329 (شامل K329، R330 و R337). در اين مطالعه، جهش‌زايي هدفدار در ناحيه R330 صورت گرفت كه آرژنين با گلوتامين جايگزين شد و اثر آن بر ساختار و عملكرد لوسيفراز مورد بررسي قرار گرفت. براساس نتايج پروتئوليز محدود، اين جهش تاثير قابل توجهي نسبت به نمونه وحشي نداشت اما چندين تغيير مانند تغيير pH اپتيمم از 5/7 به 8 و افزايش غيرفعال‌شدن حرارتي در خصوصيات آنزيم ايجاد كرد. براساس نتايج، اگرچه آرژنين 330 يك رزيدوي حفاظت‌شده است ولي روي پايداري در برابر هضم پروتئوليتيكي تريپسين تاثيري نداشت.

Luciferase from firefly Photinus pyralis (P .py) is a peroxisomal enzyme that converts a heterocyclic substrate luciferin to an excited state oxyluciferin in the presence of Mg+2-ATP and O2. Excited oxyluciferin with the emission of visible light is changed to its ground state. The combination of rapidity, sensitivity, and convenience has led to the development of a broad range of luminescence applications. In spite of wide ranges applications, firefly luciferase is unstable against changes in chemical and physical conditions, thereby reduce its precision and sensitivity. The most undesirable instability of the luciferase is low thermostability and high susceptibility to proteolytic degradation. According to previous studies, limited proteolysis by trypsin of P .py luciferase indicated six cleavage sites on two accessible regions: 206-220 (Including K206, R213, and R218) and 329-341 (Including K329, R330, and R337) on N-terminal domain. In this study, we used site-directed mutagenesis to introduce one point mutation on the 329-341 accessible regions of P. py luciferase, in order to investigate the role of R330 on the enzyme structure and function which R330 changed to Q. Based on limited proteolysis data, R330Q mutant didn’t significantly change compared to wild type, but this mutation caused several alterations in enzymatic properties including shifting the pH optimum from 7.5 to 8 and increasing the thermal inactivation. Based on the results, it can be concluded that whilst Arg330 is a conserved residue but not effects on trypsinolysis stability.