تخليص فيوژن پپتيد نوتركيب حاوي تگ تمايلي به هيدروكسي‌آپاتيت با كمك ستون كروماتوگرافي سراميكي

Purification of Recombinant Fusion Peptide Containing Hydroxyapatite Affinity Tag Using Ceramic Chromatography Column

مقدمه: امروزه ترميم بافت استخواني با افزايش اختلالات و آسيب‌هاي استخواني از اهميت خاصي برخوردار است. مهندسي بافت استخوان، راهكارهاي ويژه‌اي را براي رفع اين مشكلات فراهم كرده است. مطالعه حاضر با هدف تخليص فيوژن پپتيد نوتركيب حاوي تگ تمايلي به هيدروكسي‌آپاتيت با كمك ستون كروماتوگرافي سراميكي انجام شد. مواد و روش‌ها: در مطالعه حاضر، نوعي پپتيد فيوژن طراحي شد كه از يك‌سو حاوي توالي دمين اتصالي به هپارين بود كه مي‌تواند به انواع مختلفي از فاكتورهاي رشد دخيل در ترميم بافت متصل و باعث به‌دام‌انداختن اين فاكتورها در محل ضايعه شود و از سوي ديگر حاوي يك تگ بود كه شامل توالي به‌دست‌آمده از يك مطالعه آزمايشگاهي مبتني بر بيان فاژي است. علت قراردادن اين تگ، اتصال پپتيد به داربست حاوي هيدروكسي‌آپاتيت و تخليص پپتيد نوتركيب توسط ستون هيدروكسي‌آپاتيت بود. بنابراين توالي ژن براي بيان در ميزبان پروكاريوتي E. coli ﺳﻮﻳﻪ BL21 بهينه‌سازي و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزيم‌هاي SacI و BamHI در وكتور بياني pET-21a(+) ساب‌كلون شد. بيان پپتيد نوتركيب از طريق روش‌هاي SDS-PAGE و وسترن‌بلات بررسي شد. براي بهينه‌كردن شرايط تخليص، با اعمال تغييرات اساسي در روش كار اصلي شركت سازنده، تخليص دو مرحله‌اي انجام شد. اين پپتيد با تمايل بالايي به ستون متصل و با خلوص قابل قبولي تخليص شد. در نهايت وجود تجمعات پپتيدي از طريق روش DLS بررسي شد. يافته‌ها: نتايج كلوني PCR، هضم آنزيمي با استفاده از آنزيم‌هاي SacI و BamHI و تعيين توالي حاكي از صحت فرآيند كلونينگ بود. از طرفي بيان پپتيد فيوژن توسط روش‌هاي SDS-PAGE و وسترن‌بلات تاييد و مهاجرت آن روي ژل باعث ظاهرشدن باندي در حدود 12كيلودالتون شد. تغييرات ايجادشده در روش كار شركت سازنده باعث شد فرآيند تخليص به‌صورت مطلوبي انجام شود و در نهايت نتايج روش DLS هم خلوص پپتيد تخليص شده را نشان داد. نتيجه‌گيري: نتايج نشان‌دهنده بيان مطلوب و خلوص قابل توجه پپتيد فيوژن طراحي‌شده در اين مطالعه است.

Introduction: Nowadays, bone tissue repair with increasing bone disorders and injuries have special importance. Bone tissue engineering provided specific solutions to these problems. The present study was conducted with the aim of purification of recombinant fusion peptide containing hydroxyapatite affinity tag using the ceramic chromatography column. Material & methods: In this study, a fusion peptide was designed which at one side comprised the heparin-binding domain sequence, which can be attached to various types of growth factors involved in tissue repair and entrap these factors at the site of the lesion. On the other side, it contained a tag, which included a sequence derived from a laboratory study based on phage expression. The reason for keeping the sequence of this tag is to attach the peptide to the scaffold containing hydroxyapatite and purifying the recombinant peptide by the hydroxyapatite column. Therefore, the gene sequence was optimized and synthesized for expression in the prokaryotic host of E.coli strain BL21. Then the gene sequence was subcloned by double digestion with the SacI and BamHI enzymes into the expression vector of pET-21a(+). The expression of the recombinant peptide was investigated by SDS-PAGE and western blot. In order to optimize the purification conditions, two-step purification was carried out by applying fundamental changes in the main work method of the manufacturer company and was purified with acceptable purity. Finally, the existence of peptide assemblies was investigated by the SLD method. Finding: The results of PCR cloning, enzymatic digestion using SacI and BamHI enzymes and sequencing indicated the accuracy of the cloning process. On the other hand, expression of the fusion peptide was confirmed by SDS-PAGE and Western blot techniques, and its migration onto the gel resulted in a band cleavage of about 12 kDa. Changes made to the manufacturer's workflow allowed the purification process to be optimized and the results of the DLS method showed the purity of the purified peptide. Conclusion: The results indicate the desirable expression and remarkable purity of the fusion peptide designed in this study.