كلون سازي و بيان دُمين خارج سلولي رسپتور 2 VEGF انساني در پيكيا پاستوريس و بررسي خواص اتصالي آن

Cloning and Expression of Extracellular Domain of Human VEGF Receptor-2 in Pichia pastoris and Investigation of it's Binding Properties

آنژيوژنز[1] غيرطبيعي با بيماري­هاي مختلف نظير سرطان و متاستاز آن، رتينوپاتي و آرتريت روماتوئيد در ارتباط است. VEGF-A[2] مهمترين واسطه­ي آنژيوژنز در ميان تمام فاكتورهاي رشد است. فعاليت زيستي VEGF توسط دو گيرنده تيروزين كينازي VEGFR-1 و VEGFR-2 سلول­هاي اندوتليال وساطت مي­شود. سيگنالينگ VEGF از طريق VEGFR-2 مسير اصلي آنژيوژنز است كه منجر به تحريك رشد سريع سلول­هاي اندوتليال به داخل تومور مي­شود. اين رسپتور از يك بخش خارج سلولي، يك بخش سيتوپلاسمي و يك دُمين ترانس ممبران تشكيل شده است. بخش خارج سلولي متشكل از هفت دُمين شبه ايمونوگلوبولين (D1-D7) است كه دُمين هاي اول تا سوم به عنوان جايگاه اتصال ليگاند عمل مي­كنند. در اين مطالعه دُمين هاي خارج سلولي 3-1 گيرنده (KDR1-3) بصورت نوتركيب در Pichia pastoris بيان شد. يك قطعه DNA 975 نوكلوتيدي حاوي دُمين هاي 3-1 براساس توالي نوكلئوتيدي در GenBank و توالي پروتئين در Swiss-Prot طراحي شد. وكتور بياني ترشحي نوتركيب (pPinkαHC/KDR1-3) ساخته شد و به روش الكتروپوريشن به داخل مخمر منتقل شد. سلول هاي نوتركيب با بيان بالا از طريق تكميل اگزوتروفي آدنين شناسايي و كشت شدند. KDR1-3 تحت القا با متانول 1٪ بيان و با SDS-PAGE و تكنيك وسترن بلات تاييد شد. پس از تخليص با كروماتوگرافي تمايلي با رزين Ni-NTA، اتصال محصول بيان شده به hVEGF165 با الايزاي مستقيم و الايزاي مبتني بر گيرنده اثبات شد. نتايج نشان داد كه دُمين خارج سلولي 3-1 گيرنده VEGFR-2 انساني با ساختار پروتئين يوكاريوتي، كه هيچ گزارشي در مورد آن وجود ندارد، با موفقيت بيان شد.

Abnormal angiogenesis is associated with various diseases such as solid tumors and metastasis, retinopathies, and rheumatoid arthritis. VEGF-A is the most important mediator of angiogenesis among all growth factors. The bioactivity of VEGF is mediated by two tyrosine kinase receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 present on endothelial cells. VEGF signaling through VEGFR-2 is the major angiogenic pathway that leads to stimulation of endothelial cell ingrowths into the tumor. It comprised of an extracellular portion, a cytoplasmic portion, and a short transmembrane domain. The extracellular portion consists of seven Ig-like domains (D1–D7), of which the 1st to 3rd domains function as ligand-binding sites. In the present work, a soluble recombinant extracellular domain 1-3 of VEGFR-2 was expressed in Pichia pastoris to inhibit the VEGF-induced angiogenesis. The 975 bp DNA fragment containing extracellular domain 1-3 kdr, was designed according to the nucleotide sequence at GenBank and protein sequence at Swiss-Prot. The recombinant secretory expression vector (pPinkαHC/KDR1-3) was constructed and transferred into yeast by electroporation. The high expression transformants were identified through complementation of adenine auxotrophy and cultured. KDR1-3 was expressed under the induction of %1 methanol and confirmed by using SDS-PAGE and western blot techniques. After being purified by affinity chromatography using Ni-NTA resins, binding of expressed product to hVEGF165 was proved by two direct ELISA and ELISA receptor binding assays. The data showed that human VEGFR-2 extracellular domain 1-3 with eukaryotic protein structure, that there is no reported paper about, was successfully expressed.