بررسي اثر تزريق داخل صفاقي نانوذره كيتوزان همراه شده با آنتي‌ژن هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا ماژور برعملكرد ماكروفاژها در مواجهه با انگل در موشهاي BALB/c

Effect of Intra-Peritoneal Injection of Chitosan Nanoparticle Loaded with Leishmania major Excretory-Secretory Antigens on Macrophage Function in Exposure to Parasites in BALB/c Mice

سابقه وهدف: ليشمانيا ماژور عامل بيماري ليشمانيوز است. اين بيماري در حال حاضر به يك مشكل بهداشت عمومي تبديل شده است. تعديل پاسخ هاي سيستم ايمني به نحوي كه بتواند عفونت يا تكثير انگل را مهار كند، يك راه موثر در غلبه بر ليشمانيوز خواهد بود. آنتي ژن هاي ترشحي- تراوشي انگل ليشمانيا، نقش تعديل كنندگي سيستم ايمني را بر عهده دارند، از اين رو در طراحي واكسن و روش هاي ايمونوتراپي به كار گرفته مي شوند. به نانوذرات با توجه به ويژگي هايي كه در تحريك سيستم ايمني دارند، در سال هاي اخيرمورد توجه قرار گرفته اند. هدف از اين تحقيق، توليد تركيبي از نانوذرات و آنت يژن هاي ترشحي-تراوشي است كه بتواند پاسخ ايمني را القا كند. مواد و روش ها: در اين مطالعه تجربي كه روي ماكروفاژهاي صفاقي موش انجام شده است، آنتي ژن هاي ترشحي- تراوشي انگل ليشمانيا ماژور از سوپرناتانت كشت انگل با استفاده از اولتراسانتريفيوژ جدا شده و محدوده وزن مولكولي پروتئيني و مقدار آن به روش SDS-PAGE و برادفورد تعيين شد. سپس اين آنتي ژن ها با نانوذره كيتوزان همراه شدند و صحت آن با FTIR تاييد شد. براي بررسي خاصيت كشندگي نانوذره بر ماكروفاژها، تست MTT انجام شد. پنج گروه موش ماده BALB/c در روزهاي 10،21 ، 0 به صورت داخل صفاقي با نانوذره و نانوذره همراه با پروتئين حساس شدند. ماكروفاژها در روز 28 از موش ها جدا شده و به مدت يك ساعت با انگل مجاور شدند. بعد از 72 ساعت انكوباسيون، ميزان توليد NO و مهار رشد انگل در پاسخ به ليشمانيا بررسي و با تست آماري One-WayANOVA آناليز شد. نتايج: در بررسي انجام شده، آنتي ژن هاي ترشحي- تراوشي انگل ليشمانيا ماژور در محدوده وزني 75 - 110 كيلو دالتون قرار داشتند و با راندمان 76 درصد با نانوذرات كيتوزان همراه شدند. نتايج به دست آمده نشان داد كه آنتي ژن هاي ترشحي- تراوشي انگل ليشمانيا ماژور به تنهايي سبب افزايش معنا دار توليد نيتريك اكسايد در ماكروفاژها مي شود و حضور كيتوزان اين افزايش را تقويت مي كند( P<0.01 ). همچنين گروهي كه آنت يژن هاي ترشحي- تراوشي انگل ليشمانيا ماژور همراه شده با كيتوزان را دريافت كرد هاند، ك مترين ميزان تكثير انگل را نشان دادند( .(P<0.05 ) نتيجه گيري: آنتي ژن هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا ماژور اگر با نانوذره كيتوزان همراه شوند، مي توانند از راه افزايش توليد نيتريك اكسايد، عملكرد كشندگي ماكروفاژ را افزايش دهند. از اين رو مي توانند به عنوان كانديدايي براي توليد واكسن و بهبود بيماري مطرح شوند.

Background: Leishmania major (L.major) is a causative agent of leishmaniasis. The disease has now become a public health problem. Modulation of the immune responses to inhibit the infection or the proliferation of the parasite is an effective way to overcome the leishmaniosis. Leishmania parasite secretory-excretory antigens are responsible for immune system modulation; therefore, they are used in vaccine design and immunotherapy. Nanoparticles have been considered in recent years due to the features that stimulate the immune system. The purpose of the present study was to produce a combination of nanoparticles and secretory-excretory antigens to induce immune responses. Materials and methods: L.major secretory-excretory antigens were isolated from supernatant of parasite culture using ultracentrifugation and protein molecular weight and concentration were determined using SDS-PAGE and Bradford methods. The chitosan nanoparticle were loaded with antigens which confirmed by FTIR. MTT test was performed to determine the cytotoxic effect of nanoparticles on macrophages. Five groups of female BALB/c mice were sensitized with nanoparticles and nanoparticles loaded with the protein on days 0.10 and 21. The macrophages were isolated from the mice and infected with L.major for one hour. After 72 hours of incubation, NO production and inhibition of parasite growth were measured in response to L.major. Result: In the present study, the excretory-secretory antigens of the L.major were in the range of 75-110 kDa, and loaded with chitosan nanoparticle by %76 efficacy. The results showed that the excretory-secretory antigens of the L.major parasites significantly increased the production of nitric oxide in the macrophages and the presence of chitosan induced this increase (P<0.01). In addition, the group that received chitosan loaded with the excretory secretory antigens of the L.major showed the least proliferation of the parasites (P<0.05). Conclusion: If chitosan nanoparticles loaded with L.major excretory-secretory antigens can increase the activity of macrophage killing function by increasing nitric oxide production; therefore, they can be nominated as candidates for vaccine development and disease improvement.