عنوان مقاله :
كلونينگ و بيان ژن اينترلوكين15 در باكتري E. coli سويه Rosetta (DE3)
عنوان به زبان ديگر :
Cloning and Expression of IL-15 Gene in E. coli, Rosetta (DE3) Strain
پديد آورندگان :
بحرالعلومي شاپورآبادي، مينا انستيتو پاستور ايران - بخش ويروس شناسي مولكولي، تهران، ايران , آرش كيا، آرش انستيتو پاستور ايران - بخش ويروس شناسي مولكولي، تهران، ايران , محجل، نصير انستيتو پاستور ايران - بخش ويروس شناسي مولكولي، تهران، ايران , روحوند، فرزين انستيتو پاستور ايران - بخش ويروس شناسي مولكولي، تهران، ايران , آزادمنش، كيهان انستيتو پاستور ايران - بخش ويروس شناسي مولكولي، تهران، ايران
كليدواژه :
اينترلوكين15 , بيان پروتئين نوتركيب , اشريشيا كولي
چكيده فارسي :
اينترلوكين15 (IL-15)، سايتوكايني است كه به واسطه فعاليت‌هاي فيزيولوژيكي آن مي‌تواند در درمان‌هاي ضدسرطان نقش ايفا كند. IL-15 باعث تمايز، تكثير، فعال‌شدن و بقاي سلول‌هاي كشنده طبيعي مي‌شود و بقاي لنفوسيت‌هاي T خاطره‌اي را بهبود مي‌بخشد. از آنجايي كه راندمان توليد و تخليص اين سايتوكاين عمدتاً پايين است، علي‌رغم پيشرفت‌هاي اخير، همچنان بهينه‌كردن شرايط توليد، ارزشمند است. بنابراين در مطالعه حاضر، اقدام به كلون و بيان ژن IL-15 انساني در باكتري متفاوت با سويه‌هاي قبلي شد و به جاي بيان در باكتري E. coli سويه رايج BL21، از سويه Rosetta (DE3) استفاده شد كه قادر است با استفاده از كدون‌هاي نادري كه در باكتري كمتر مورد استفاده قرار مي‌گيرند، بيان ژن‌هاي يوكاريوتي را بهتر از سويه‌هاي ديگر انجام دهد، به‌طوري كه پروتئين بيان‌شده شباهت بيشتري به پروتئين انساني داشته باشد. پس از سنتز ژن IL-15، توالي مورد نظر در وكتور بياني باكتريال pET28a كلون شد و پس از تاييد با كلنيPCR، هضم آنزيمي با آنزيم‌هاي BamHI و XhoI و مشاهده باند 391 بازي روي ژل آگارز و تعيين توالي، در باكتري E. coli سويه Rosetta (DE) ترانسفورم شد. القاي بيان در جذب نوري 0/6 در OD600 و در حضور 1ميلي‌مولار ايزوپروپيل- بتا- دي- تيوگالاكتوپيرانوزيد (IPTG) انجام شد. مشاهده باند 15كيلودالتوني روي ژل SDS-PAGE و سپس انجام وسترن‌بلات به كمك آنتي‌بادي اختصاصي تجاري عليه IL-15، نشان از درستي فرآيند بيان داشت. راندمان بيان به كمك دانسيتومتري با نرم‌افزار Fiji حدود 37% تخمين زده شد. با توجه به اينكه بيان ژن انساني IL-15 در سويه باكتريايي E. coli Rosetta (DE3) انجام شده است، انتظار مي‌رود كه در مطالعات بعدي، عملكرد مناسبي از خود نشان دهد.
چكيده لاتين :
Interleukin 15 (IL-15) is a cytokine that, due to its physiological activity, can play a role in anticancer
therapies. It shows positive effect on Natural Killer cells differentiation, proliferation,
activation, and surveillance and also on surveillance of memory CD8+ T cells. However, the
expression and purification yield of recombinant IL-15 is low. So, it worth improving the
production conditions of this useful protein. Therefore in the present study, cloning and
expression of human IL-15 are reported in E. coli, strain Rosetta (DE3) which is different
from previous bacterial hosts BL21 strain. This strain (Rosetta DE3) has the potential to use
codons rarely used by bacteria and consequently, the expressed protein can be more similar
to the human protein. First, the human IL-15 coding sequence was synthetized, and then the
sequence was cloned into pET28a plasmid. Confirming the accuracy of the final construct was
done by colony PCR, restriction analysis (which was done using BamHI and XhoI restriction
enzymes and the expected 391bp band was observed) and sequencing. Then, the recombinant
construct was transformed into competent E. coli Rosetta (DE3) bacteria. Expression was
done in OD600 of 0.6 in the presence of 1mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
Protein characterization was done by SDS-PAGE and then by western blotting using a specific
commercial anti-IL-15 antibody. The 15kDa band on the gel and blot, showed the presence of
IL-15. Densitometry by Fiji software determined 37% production yield. It is expected a suitable
function from this produced recombinant cytokine due to expression in E. coli Rosetta (DE3)
in future studies.
عنوان نشريه :
پژوهش هاي آسيب شناسي زيستي
