عنوان مقاله :
تشخيص اتصال پپتيد ضد رگزايي به سلول‌هاي HUVEC با استفاده از FITC
عنوان به زبان ديگر :
Diagnosis of Anti-Angiogenesis Peptide Binding to HUVECs Using FITC
پديد آورندگان :
اميني سپهر، فهيمه دانشگاه گيلان، رشت - گروه زيست شناسي , اصغري، محسن دانشگاه گيلان، رشت - گروه زيست شناسي , شوريان، مصطفي دانشگاه گيلان، رشت - گروه زيست شناسي
كليدواژه :
پپتيد ضدرگ‌زايي , فلوئورسين ايزوتيوسيانات , سلول‌هاي اندوتليال بندناف انساني
چكيده فارسي :
زمينه و هدف: رگزايي توليد عروق خوني جديد از عروق موجود است. رگزايي وابسته به وجود تعادل بين فاكتورهاي فعال كننده و مهار كننده آن است. اندواستاتين، يك قطعه 20 كيلو دالتوني از كلاژن XVIII و عضوي از گروه پروتئينهاي مهار كننده رگزايي ميباشد كه تكثير و مهاجرت سلول‌هاي اندوتليال و تشكيل ساختار لوله مانند را مهار ميكند. استفاده از روشهاي رنگ سنجي به واسطه پروبهاي فلورسنت به عنوان ردياب، كاربرد گسترده‌اي دارد، لذا هدف از اين مطالعه تعيين و تشخيص اتصال پپتيد ضد رگزايي به سلول‌هاي اندوتلياي بند ناف انساني با استفاده از يك نشانگر فلورسنس بود.
روش بررسي: در اين مطالعه تجربي قطعه 27 آمينواسيدي مربوط به دمين انتهاي آمينوي پروتئين اندواستاتين، با FITC به عنوان يك نشانگر فلورسنس، نشانه‌گذاري شد. از روش كروماتوگرافي ژل فيلتراسيون به وسيله سفادكس G10 براي جداسازي پپتيدهاي اتصال يافته استفاده شد و در نهايت به منظور تأييد اتصال FITC به پتيد از روش FTIR استفاده شد. سلول‌هاي اندوتليال بندناف انساني بعد از كشت با پپتيدهاي اتصال يافته به نشانگر تيمار شدند و با استفاده از ميكروسكپ فلورسانس به منظور مشاهده اتصال پپتيد به رسپتور خود بر روي سطح اين سلول‌ها مطالعه گرديد.
يافته‌ها: نتايج اين مطالعه با ميكروسكوپ فلورسانس اتصال اين پتيد ضد رگزايي به گيرنده مخصوص خود بر روي سلول‌هاي اندوتليال را تأييد ميكند. جهت رسيدن به شرايط مناسب براي نشانه‌گذاري پپتيدها، شرايط مختلف آزمايشي از قبيل غلظت پپتيد و FITC و زمان و دماي انكوبه شدن مورد بررسي قرار گرفت. FITCهاي آزاد به وسيله روش كروماتوگرافي ژل فيلتراسيون از نمونه‌هاي كانژوگه FITC-peptideجدا شدند. سلول‌هاي اندوتليال بند ناف انساني (HUVEC) كشت داده شده با نمونه‌هاي كانژوگه FITC-peptide تيمار شد. سپس سلول‌ها تثبيت و به وسيله ميكروسكوپ فلوئورسانس مطالعه شدند.
نتيجه‌گيري: در اين تحقيق اتصال بين FITC، به عنوان يك پروب فلورسانس به پپتيد در يك شرايط بهينه انجام شد. به علاوه نشان داديم كه اين كمپلكس قابل جداسازي ميباشد. از طرفي نتايج تحقيقات حاكي از اين است كه پپتيد مشتق از اندواستاتين به نحو مؤثري به سلول‌هاي HUVEC متصل شده است. اين روش راهكار درستي براي شناسايي اين اتصال ميباشد. اتصال پروب فلورسنت به پپتيد مي‌تواند به عنوان يك ابزار مولكولي مناسب براي مطالعات آينده در دو حوزه in vitro و in vivoاستفاده شود
چكيده لاتين :
Background & aim: Angiogenesis is the production of new blood vessels from existing vessels. Angiogenesis depends on the balance between its activating and inhibitory factors. Endostatin, a 20-kDa fragment of
collagen XVIII, is a member of the angiogenesis inhibitory protein group that inhibits endothelial cell
proliferation and migration and tubular-like structure. The use of colorimetric methods by fluorescent probes as
a tracer is widespread, so the aim of this study was to determine and detect the binding of anti-angiogenic
peptide to human cord endothelial cells using a fluorescence marker.
Methods: In the present experimental study, the 27 amino acid fragment of the endostatin protein amino acid
domain was labeled with FITC as a fluorescence marker. Gel filtration chromatography with Sephadex G10
was used to separate the bound peptides and finally FTIR method was used to confirm the binding of FITC to
the peptide. Human umbilical cord endothelial cells were treated with marker-bound peptides after culturing
and studied by fluorescence microscopy to observe peptide binding to their receptor on the surface of these
cells.
Results: findings by Fluorescence microscopy confirmed binding antiangiogenic peptide to its specific
receptor. Various conditions such as concentration, time, and temperature were tested to achieve the proper
conditions for marking peptides. Unlabeled FITCs separated by gel filtration Chromatography method with
sephedex G10. Human umbilical endothelial cells (HUVECs) are harvested and treated with conjugate samples
(FITC-peptide) from gel filtration chromatography. After the required time, the cells were fixed and the binding
of labeled peptides to their receptors on HUVECs was analyzed by Fluorescence microscope. Conclusion: The results of fluorescence microscopy confirmed the binding of this antiangiogenic peptide to its
specific receptor on endothelial cells. Different experimental conditions such as peptide concentration and
FITC and incubation time and temperature were studied to obtain the appropriate conditions for peptide
labeling. Free FITCs were separated by conjugated FITC-peptide samples by gel filtration chromatography.
Human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) cultured with FITC-peptide conjugated samples were treated.
The cells were then fixed and examined by fluorescence microscopy.
عنوان نشريه :
ارمغان دانش
