طراحي آغازگرهاي واكنش زنجيره‌اي پليمراز و كارايي آنها به منظور شناسايي جهش‌هاي ژن FAH عامل بيماري تيروزينمي نوع يك

Design of Polymerase Chain Reaction Initiators and Their Function to Identify FAH Mutations in Type I Tyrosinemia

زمينه و هدف: تيروزينمي نوع يك بيماري اتوزومي مغلوب به دليل نقص آنزيم فوماريل استواستات هيدرولاز(FAH) مي­ باشد، تا كنون حدود 40 جهش پاتوژن براي اين ژن معرفي شده است. هدف از اين تحقيق تعيين و طراحي آغازگرهاي واكنش زنجيره‌اي پليمراز و كارايي آنها به منظور شناسايي جهش‌هاي ژن FAH عامل بيماري تيروزينمي نوع يك بود. . روش بررسي: در اين مطالعه موردـ شاهدي، 12 نفر وارد مطالعه شدند و در دو گروه مساوي؛ اول شش نفر مبتلا به بيماري تيروزينمي نوع يك و گروه دوم شش نفر غير مبتلا، پس از اخذ رضايت آگاهانه نمونه خون استخراج شد و سپس استخراج DNA از نمونه‌هاي خون انجام گرفت. براي قسمت­هايي از ژن كه در پژوهش‌هاي قبلي جهش گزارش شده بود، آغازگر واكنش زنجيره ­اي پليمراز طراحي شد. اختصاصيت آغازگرهاي طراحي شده با بانك‌هاي اطلاعاتي آنلاين مورد ارزيابي قرار گرفت. سپس طي واكنش زنجيره ­اي پليمراز قطعات ژن تكثير شد. سپس قطعات تكثير يافته پس از تخليص تعيين توالي شدند و در نهايت آناليز توالي به منظور پيدا كردن جهش عامل بيماري انجام گرفت. يافته‌ها: آغازگرهاي طراحي شده قطعات ژن FAH را به طور كاملاً اختصاصي تكثير كردند. توالي­يابي قطعات تكثير شده منجر به شناسايي جهش بي‌معني +709 C>T در اگزون 10 ژن هر شش مورد بيمار مورد مطالعه گرديد. والدين افراد بيمار ناقل اين جهش ژنتيكي بودند. در هيچ يك از افراد گروه كنترل جهش ژنتيكي در ژن FAH يافت نشد. نتيجه‌گيري: جهش بي‌معني +709 C>Tيك جهش بيماري‌زا در ژن FAH مي‌باشد كه قبلاً فقط در تركيه گزارش شده بود. آغازگرهاي طراحي شده به طور مقرون به صرفه و به طور اختصاصي قادر بودند ژن FAH را تكثير كنند. هم‌چنين ميتوان از اين آغازگرها جهت شناسايي افراد ناقل بيماري و همين‌طور تشخيص قبل از تولد بيماري تيروزينمي نوع يك استفاده كرد.

Background & aim: Tyrosinemia is a recessive autosomal genetic disease due to the defect of fumaril acetoacetate hydrolase (FAH). About 40 pathogenic mutations have been reported for this gene. The aim of the present study was to determine and design polymerase chain reaction primers and their ability to identify FAH gene mutations causing type I tyrosinemia. Methods: In the present case-control study, 12 patients were recruited and divided into two equal groups: first six patients with type I tyrosinemia and second group six patients without informed consent. Blood samples were taken. Then, the DNA was extracted. The polymerase chain reaction initiator was designed for parts of the gene which reported in previous studies of the mutation. The specificity of primers designed with online databases was evaluated. Gene fragments were amplified by polymerase chain reaction. Then the amplified fragments were sequenced after purification. Finally the sequenced regions analyzed by Vector NTI software. Results: Designed primers amplified FAH gene segments specifically and sequencing of amplified segments revealed +709 C>T mutation in exon 10 of FAH gene. The patient's parents were carriers of this genetic mutation. In the control group no mutation was found in the FAH gene. Conclusion: The nonsense mutation 709 C> T is a pathogenic mutation in the FAH gene that was previously reported only in Turkey. The designed primers were cost-effective and specifically able to amplify the FAH gene. These primers can also be used to identify carriers of the disease as well as prenatal diagnosis of type I tyrosinemia.