ساخت سويه بياني مخمر نوتركيب مولد EpEX به‌عنوان انتخابي مناسب در تشخيص و درمان سرطان

هدف: مولكول چسبان سلول اپيتليال (EpCAM) يك گليكوپروتئين غشايي است كه بيان آن در اكثر تومورهاي با منشأ اپيتليالي افزايش مي‌يابد و لذا مي‌تواند در شناسايي و درمان سرطان‌ها با كمك روش‌هاي ايمونولوژيكي به‌عنوان يك هدف مناسب به‌كار گرفته شود. لذا توليد نوتركيب اين پروتئين به فرم طبيعي حايز اهميت مي‌باشد. در دو دهه‌ي گذشته مخمر پيكيا پاستوريس به‌دليل دارا بودن مزاياي هر دو سيستم بياني پستاندار و پروكاريوتي، به‌عنوان ميزبان رايج در توليد پروتئين‌هاي نوتركيب مطرح بوده است. در اين مطالعه پيكيا بيان‌كننده بخش خارج سلولي EpCAM ساخته شده است. مواد و روش‌ها: ژن بهينه شده‌ي كدوني مولد پروتئين EpEX در محل‌هاي برشي آنزيم‌هاي XhoI و XbaI وكتور pPICZαB همسانه‌سازي شد. سازه نوتركيب با كمك الكتروپوراسيون در سويه GS115 وارد شد. كلون‌هاي مثبت با كمك PCR و با استفاده از جفت پرايمر مربوط به ژن AOX1 ارزيابي شدند. يافته‌ها: صحت ساخت سازه نوتركيب pPICZαB-EpEX با استفاده از توالي‌يابي و آناليز آنزيمي با استفاده از آنزيم‌هاي XhoI و XbaI (باندهاي 3506 و 843 جفت باز) هم‌چنينBamHI (باندهاي 3651 و 698 جفت باز) تأييد شد. نتايج حاصل از غربالگري بر پايه PCR، زماني‌كه دو پرايمر مربوط به ژن AOX1 به‌كار گرفته شد، نشان‌دهنده‌ي حضور دو باند (2200 و 1345 جفت باز) در كلون‌هاي نوتركيب بود. نتيجه‌گيري: ساخت سويه مهندسي شده مولد EpEX در اين مطالعه تأييد شد. از اين سويه ساخته شده مي‌توان در توليد پروتئين نوتركيب EpEX جهت اهداف تشخيصي و درماني استفاده كرد

Introduction: Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is a membrane glycoprotein that is overexpressed on the majority of tumor cells of epithelial origin and thereby can be used as a target of immunodetection and immunotherapy of cancer. So, it is important to produce this protein in its native form. Interestingly, during the last two decades, the yeast Pichia pastoris (P. pastoris) has become a popular host for the production of recombinant proteins because it combines the advantages of both mammalian and prokaryotic expression systems. In this study, the Pichia expressing EpCAM extracellular domain (EpEX) was constructed. Materials and Methods: The codon optimized gene encoding EpEX protein was cloned in the XhoI and XbaI restriction sites of the pPICZαB vector. The constructed plasmid was integrated into GS115 strain by electroporation. Positive clones were evaluated by PCR using AOX1 primers. Results: Sequencing as well as restriction enzyme analysis utilizing XhoI and XbaI (3506, 843 bp bands), as well as BamHI (3651, 698 bp bands) confirmed construction of recombinant EpEX pPICZαB. PCR based screening results of integrants showed two bands (2200 and 1345 bp), when AOX1 primer set was used. Conclusion: These findings imply that the engineered strain was constructed. The constructed strain can be used in EpEX recombinant protein production for diagnostic and therapeutic purposes.