تعيين ارزش تشخيصي PCR-ELISA نسبت به روش‌هاي كلاسيك و PCR براي شناسايي سويه‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس مقاوم به متي‌سيلين

Determination of PCR-ELISA Diagnostic Value in Comparison With Classical Methods and PCR to Detect Resistance to Methacillin

زمينه و هدف: شيوع بالاي ايزوله‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس كه به آنتي‌بيوتيك متي‌سيلين مقاوم هستند و همچنين ايجاد مقاومت چند دارويي در اين باكتري، درمان عفونت‌هاي ناشي از اين باكتري را با مشكل مواجه كرده است. به همين خاطر شناسايي سويه‌هاي MRSA با روش‌هاي سريع و دقيق ضروري است. PCR-ELISA روش مولكولي دقيقي است كه براي شناسايي باكتري‌هاي مختلفي استفاده شده است. هدف از اين تحقيق شناسايي باكتري استافيلوكوكوس اورئوس مقاوم به متي‌سيلين با روش PCR-ELISA است. مواد و روش كار: ابتدا پرايمرهاي اختصاصي مربوط به ژن mecA طراحي شد. سپس از dNTP نشان‌دارشده به همراه ديگوكسي ژنين براي تكثير ژن mecA استفاده شد. محصولات نشان‌دارشده به كف چاهك‌هاي واجد استراپتويدين متصل و با آنتي‌بادي كانژوگه ضدنشان DIG شناسايي شد. همچنين از پروب DNA اختصاصي نشان‌دارشده با بيوتين براي ژن mecA استفاده و در نهايت حساسيت و اختصاصيت روش تعيين شد. براي اين منظور مقاومت به متي‌سيلين در 70 جدايه باليني با روش انتشار ديسك، آگار دايلوشن و PCR-ELISA ارزيابي شد. يافته‌ها: با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي، ژن mecA باكتري استافيلوكوكوس اورئوس تكثير شد كه نتيجه آن يك قطعه به طول 310 جفت باز بود. نتايج حاصل از PCR-ELISA نشان داد اين تكنيك هيچ واكنش متقاطعي با باكتري‌هاي كلبسيلا پنومونيه، باسيلوس سوبتليس و اشريشياكلي به عنوان كنترل ندارد و همچنين ميزان حساسيت آن 0/5 نانوگرم ارزيابي شد. فراواني جدايه‌هاي باليني مقاوم به متي‌سيلين با روش انتشار ديسك، آگار دايلوشن و PCR-ELISA به ترتيب 60، 58/5 و 60 درصد بود. نتيجه‌گيري: تكنيك PCR-ELISA به عنوان روشي حساس و دقيق به منظور شناسايي عوامل بيماري‌زا با استفاده از ژن اختصاصي آنها شناخته شده است. اين روش مي‌تواند به عنوان روش جايگزين مناسبي براي تكنيك‌هاي زمان‌بر، با حساسيت كمتر و هزينه بيشتر همچون Real-time PCR و تست‌هاي بيوشيميايي افتراقي كه در آزمايشگاه‌ها استفاده مي‌شوند، به كار رود.

Background and Aims: High prevalence of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus isolates (MRSA) as well as the multi-drug resistance in this bacterium causes difficulties in the treatment of infections due to these bacteria. Hence, detection of MRSA isolates by rapid and accurate methods is necessary. PCR-ELISA is an accurate and molecular technique that is used for the detection of several pathogens. The aim of this study is the detection of MRSA using PCR-ELISA. Materials and Methods: Specific primers for mecA gene were designed. Then, dNTP labeled with Digoxigenin was applied for amplifying mecA gene. DIG-labeled PCR products were seeded on the well coated streptoavidin and identified by anti-DIG–peroxidase conjugate. Furthermore, Biotin-labeled DNA probe specific for mecA gene was used. Sensitivity and specificity of the method was determined. Resistance to methicillin among 70 clinical isolates was determined by the disk diffusion, agar dilution and PCR-ELISA methods. Results: MecA gene of S. aureus was amplified using gene specific primers resulted in a fragment with 310 bp length. Findings from the PCR-ELISA technic showed no cross-reactivity with Klebsiella Pneumoniae, Bacillus subtilis and Esheriashia coli as control bacteria and its sensitivity was 0.5 ng. The prevalence of MRSA clinical isolates by the disk diffusion, agar dilution and PCR-ELISA methods was 60%, 58.5% and 60%, respectively. Conclusion:The PCR-ELISA technique was known as an accurate and rapid test for the detection of infection agents using their specific gene. This technic can applied as an appropriate alternative method for time-consuming, less sensitive and expensive techniques such as Real-time PCR and differential biochemical tests which are currently used in laboratory.