جداسازي پلاسماسل از خون محيطي و هم‌كشتي با سلول استروماي مغز استخوان به منظور كشت طولاني مدت

مقدمه: فن‌آوري تهيه‌ي آنتي ‌بادي بر پايه‌ي تك سلول B روشي‌ نوين در تهيه‌ي آنتي ‌بادي مونوكلونال انساني محسوب مي‌گردد. مهم‌ترين بخش‌ اين فن‌آوري، كشت طولاني مدت پلاسماسل جدا شده از خون جهت ترشح آنتي ‌بادي است. با توجه به اين كه دليل زنده ماندن طولاني مدت پلاسماسل‌ها در مغز استخوان حضور سيگنال‌هاي اطراف آن‌ها است، جهت كشت پلاسماسل در شرايط In vitro لازم است اين سيگنال‌ها به واسطه‌ي حضور يك لايه سلول تغذيه‌ كننده تأمين شوند. به نظر مي‌رسد كه از ميان انواع مختلف اين سلول‌ها، سلول‌هاي استروماي مغز استخوان (BMSCs يا Bone marrow stromal cells) گزينه‌ي مناسب‌تري جهت هم‌كشتي با پلاسماسل محسوب مي‌گردند. هدف از اين پژوهش، جداسازي پلاسماسل‌هاي ترشح كننده‌ي آنتي ‌بادي از خون محيطي‌ و زنده نگهداشتن آن‌ها در شرايط In vitro مي‌باشد. روش‌ها: پس از تزريق واكسن كزاز، تيتر آنتي ‌بادي در سرم خون افراد داوطلب با روش ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) اندازه‌گيري شد. PBMCs (Peripheral blood mononuclear cells) جدا شده از خون فرد ايمن با آنتي ‌بادي‌هاي رنگي اختصاصي سه نشانگر سطحي 45CD، 19CD و 38CD رنگ‌آميزي شدند. پس از آن پلاسماسل‌ها به روش FACS (Fluorescence-activated cell sorting) از ساير جمعيت‌هاي سلولي موجود، جدا و در پليت 96 خانه‌اي Sort شدند. سپس همراه با يك لايه BMSCs كشت داده شدند. پس از گذشت 10 روز، از پلاسماسل‌‌ها RNA استخراج شد و واكنش RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي ژن آنتي ‌بادي انجام شد. يافته‌ها: روز ششم پس از واكسيناسيون، تيتر آنتي ‌بادي سرم، IU/ml 16 به دست آمد كه نشان از پاسخ ايمني بسيار مناسب در مقابل واكسن كزاز بود. همچنين، آناليز فلوسايتومتري نمونه‌ي خون محيطي فرد ايمن شده در روز هفتم، درصد پلاسماسل موجود در PBMCs را حدود 0/3 درصد نشان داد. در نتيجه‌ي انجام واكنش RT-PCR با پرايمرهاي اختصاصي ژن آنتي ‌بادي، قطعه‌ي VH (Variable heavy chain) به طول bp 400 تكثير شد. اين نتيجه، زنده بودن پلاسماسل‌ها و همچنين بيان ژن آنتي ‌بادي را در روز دهم در شرايط هم‌كشتي با BMSCs تأييد نمود. نتيجه‌گيري: حاصل اين پژوهش، فراهم آوردن شرايط مناسب به منظور كشت پلاسماسل براي مدت 10 روز در محيط In vitro بود. بنابراين بخشي از فن‌آوري نوين تهيه‌ي آنتي ‌بادي بر پايه‌ي تك سلول B نيز پايه‌گذاري شد. نتايج به دست آمده در اين پژوهش شامل درصد پلاسماسل موجود در PBMCs و اندازه‌ي قطعه‌ي ژني VH تكثير شده، با ساير مطالعات انجام شده در اين زمينه مطابقت داشت.