طراحي و ساخت ناقل نوتركيب CRISPR حاوي ژن LRRK2 بيماري پاركينسون

Design and Construction of Recombinant CRISPR Vector Harboring LRRK2 Gene for Parkinson's Disease

هدف: هدف از اين مطالعه تخريب ژن كيناز غني از لوسين شماره 2 (LRRK2)، مهم‌ترين ژن درگير در بيماري پاركينسون با استفاده از تكنولوژي CRISPR-Cas بود. مواد و روش ها: مراحل همسانه سازي قطعات راهنما در اين پژوهش با استفاده از كيت كلونينگ gRNA سيستم كريسپر (شماره كاتالوگ C8324K شركت زاور زيست آزما) انجام شد. ابتدا 4 اليگونوكلئوتيد براي توالي اگزون 41 ژن LRRK2 توسط نرم افزار ساخت RNA راهنماي CRISPR با عنوان CHOCHOP طراحي شدند. اين دو RNA) gRNAsراهنما) در دو طرف اگزون فوق در نظر گرفته شدند. مولكول‌هاي دو رشته اي DNA بر اساس دستورالعمل استاندارد در آزمايشگاه ساخته شدند. قطعات دو رشته اي 20 جفت بازي راهنما كه براي تشكيل كمپلكس Cas9-gRNA استفاده مي‌شوند، با استفاده از آنزيم DNA ليگاز به وكتور بياني يوكاريوتي كريسپر Px459 متصل و پلاسميدهاي نوتركيب به درون باكتري E.Coli DH5a ميزبان با روش شوك حرارتي منتقل شدند. نتايج آزمايش ها به وسيله روش هاي RCP و تعيين رديف an‎d ارزيابي شدند. نتايج: آزمايش هاي چندگانه PCR با استفاده از پلاسميدهاي نوتركيب به عنوان an‎d الگو و توالييابي AND، همسانه سازي قطعه هاي كوچك راهنما در پلاسميد بياني كريسپر را نشان داد. نتيجه گيري: نتايج حاصل از اين مطالعه نشان داد، سيستم CRISPR مي‌تواند به عنوان يك ابزار قوي فراگير براي ويرايش و تنظيم بسياري از ژن‌هاي موثر در بيماري ها از جمله بيماري پاركينسون استفاده شود.

Aim: In this study, the alteration of the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene, as the most important gene involved in Parkinson's disease, was investigated using CRISPR-Cas editing technology. Material and methods: Cloning the guide molecules of interest was performed using of gRNA CRISPR cloning kit (Catalog No. C8324K, Zaver Zist Azema). Two sets of forward and reversed gRNA oligonucleotides for exon 41 of the LRRK2 gene were designed using the CHOPCHOP CRISPR guide gRNA designing web software. Double-stranded DNA molecules were made according to standard instructions in the laboratory. 20 base-pair DNA segments were used to generate RNA-Cas-9 enzyme complex and then ligated into the Px459 CRISPR eukaryotic expression vector using Fermentas DNA ligase enzyme. Recombinant plasmids were transformed into E. coli DH5a host competent cells using of heat shock method. Results: findings by multiple PCR experiments and also DNA sequencing blast analysis showed successful cloning the segments of interest into CRISPR plasmids. Clear PCR bands were in agreement with expected values and DNA sequencing results showed 100% similarity. Conclusion: According to the results, development of CRISPR vector system may be used as a wide and powerful tool for editing and alteration of many encountered genes in different diseases such as Parkinson's disease.