بكارگيري يك روش سيستمي طراحي محيط كشت براي بهبود توليد زيست‌اتانول توسط سيانوباكتر سينكوسيستيس

Applying a system-oriented method for culture medium design to improve bio-ethanol production by synechocystis

استفاده از ابزارهاي مهندسي ژنتيك براي توليد سويه صنعتي خصوصا از ميكروارگانيسم‌هاي كمتر شناخته شده همچون سيانوباكترها همواره با محدوديت‌هايي مواجه است. در اين تحقيق، از يك روش سيستمي به كمك دانش بين رشته‌اي زيست‌شناسي سامانه‌ها براي طراحي محيط كشت بجاي طراحي سويه استفاده شد و توانمندي آن در افزايش توليد اتانول توسط سيانوباكتر سينكوسيستيس sp. PCC 6803 مورد ارزيابي آزمايشگاهي قرار گرفت. در اين روش، مواد با هدف تنظيم فعاليت آنزيم‌هاي هدف نه با هدف مصرف توسط سلول به محيط كشت افزوده مي‌شوند و بنابراين محيط كشت طراحي شده، محدوديت‌هاي درون سلولي براي توليد محصول زيستي را برطرف مي‌كند. يك مدل متابوليكي براي تعيين حداقل ميزان ترشح اتانول و شناسايي ژن‌هايي كه كاهش يا افزايش بيان آنها اين حداقل ميزان را افزايش مي‌دهند، بكار رفت. سپس، تنظيم كننده‌هاي آنزيم‌هاي بيان شده توسط ژن‌هاي هدف از پايگاه داده Brenda استخراج شد و اثر آنها بر توليد به طور تجربي ارزيابي شد و طراحي آزمايش براي بهينه‌سازي غلظت تركيبات انتخاب شده انجام شد. در ميان تركيبات شناسايي شده، دو مهار كننده (اسيد ساليسيك و كلريد جيوه) و يك فعال كننده (پيروات) براي افزودن به محيط انتخاب شدند و غلظت آنها با استفاده از روش طرح مركب مركزي بهينه‌سازي شد. محيط كشت تنظيمي پيشنهادي توليد اتانول توسط سينكوسيستيس را از 352 به 1116 ميلي‌گرم بر ليتر افزايش داد كه نشان دهنده اثربخشي تركيبات تنظيمي اضافه شده بر متابوليسم است. روش سيستمي پيشنهاد شده مي‌تواند در طراحي محيط كشت ديگر محصولات مهم صنعت زيست‌فناوري كشور همچون پروتئين‌هاي نوتركيب كاربرد داشته باشد.

The use of genetic engineering tools to produce industrial strains, especially from non-model microorganisms such as cyanobacteria, is always subject to limitations. In this research, a system-oriented method was used to design a culture medium instead of strain designing and its ability to increase ethanol production by Synechocystis sp. PCC 6803 was experimentally evaluated. In this method, compounds are added to the medium to regulate the activity of target enzymes not for the purpose of being consumed by the cells, and thus, the designed culture medium eliminates the intracellular constraints on the production. A metabolic model was used to determine the minimum level of ethanol production and to identify genes that increase or decrease of their expression increase this minimum level. Then, regulators of the enzyme expressed by the target genes were extracted from the Brenda database and their effect on the production was evaluated experimentally and design of experiment was performed to optimize the concentration of the selected compounds. Among the compounds identified, two inhibitors (salicylic acid and mercuric chloride) and one activator (pyruvate) were selected to be added to the medium and their concentration was optimized using the central composite design method. The proposed regulatory medium increased the production of ethanol from 352 to 1116 mg/l, indicating the effectiveness of the added regulatory compounds on the cyanobacteria metabolism. The proposed system-oriented method can be used to design medium culture for other important bio-products such as recombinant proteins.