تشخيص مولكولي لپتوسپيراهاي بيماري زا با استفاده از روش PCR بر اساس ژن lipl32

Molecular detection of pathogenic Leptospires based on lipL32 gene

لپتوسپيروز يكي از بيماري هاي مهم قابل انتقال از حيوان به انسان است. LipL32 يكي از مهمترين پروتئين هاي غشاي خارجي لپتوسپيرا است كه تنها در سرووارهاي بيماري زا وجود دارد و فاكتور مناسبي جهت شناسايي لپتوسپيراهاي بيماري زا مي باشد. بنابراين هدف از انجام اين پژوهش، تشخيص مولكولي لپتوسپيراهاي بيماري زا بر اساس ژن lipL32 مي باشد. در اين بررسي از سرووارهاي بيماري زا و غير بيماري زاي استاندارد لپتوسپيرا استفاده شد. باكتري ها در محيط كشت اختصاصيEMJH كشت داده شدند و DNA ژنوميك آن ها با روش استاندارد فنول كلروفرم ايزوآميل الكل تخليص گرديد. پرايمر اختصاصي جهت تكثير ژن lipL32طراحي شد. دماي اتصال (Annealing) براي اين پرايمر 61 درجه سانتي گراد، غلظت مناسب پرايمر 10 پيكومول ، ميزان حساسيت 4-10 pg/µl و همچنين تعيين ويژگي آن در PCR مورد بررسي قرار گرفت. با توجه به داده هاي PCR تاييد شد كه اين ژن فقط در سرووارهاي بيماري زاي لپتوسپيرا حضور دارد و قطعه bp 272 حاصل كه نشان دهنده تكثير ژن lip L32 مي باشد، در سرووار غير بيماري زا مشاهده نگرديد. شناسايي روش هاي سريع تشخيص لپتوسپيراهاي بيماري زا پيش از ورود به فاز حاد بيماري بسيار حائز اهميت مي باشد. بنابراين جهت تشخيص لپتوسپيراهاي بيماري زا، روش هاي مولكولي مبتني بر PCR با استفاده از ژن lipL32 كه در كوتاه ترين زمان ممكم پاسخي دقيق و قابل اعتماد ارائه مي دهند، پيشنهاد مي گردد.

Leptospirosis is one of the most important diseases Transferable from animal to human. LipL32 is one of the most important outer membrane proteins that exist only in pathogenic Leptospira spp., which is a suitable factor for the detection of pathogenic Leptospira. Therefore, the aim of this study is the molecular detection of pathogenic Leptospira based on lipL32 gene. Saprophytic and pathogenic Leptospira serovars were used in this study. The bacteria were inoculated into the selective culture medium and extraction of the genomic DNA was performed by standard Phenol-Chlorophorm method. The specific primers for proliferation of lipL32 gene were designed. In terms of annealing temperature was 61°C, suitable concentration 10 pmol, sensitivity was 2 - 11 pg/ μl and its characterization in PCR were investigated. According to PCR data, it was confirmed this gene was present only in pathogenic Leptospira serovars and 272 bp fragment indicating the replication of the lipL32 gene and was not observed in non-pathogenic species. Identify methods for rapid detection of pathogenic leptospires before entering the acute phase of the disease is very important. The results showed that PCR using lipL32 gene was high specificity and sensitivity. So for the detection of pathogenic Leptospires, molecular methods based on PCR using lipL32 gene in the shortest possible time offer accurate and reliable response is recommended.