بهينه سازي رمزه و مقايسه ي بيان فاكتوررشد اكتيوين A بصورت نوتركيب در ميزبانهاي باكتريايي BL21(DE3) ، BL21(DE3)pLysS وRosetta gami BL21(DE3)

Codon Optimization and Comparison of Recombinant Human Activin A Expression in BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3) Rosetta gami and BL21(DE3) Bacterial Hosts

پروتئين اكتيوينA متشكل از دو دايمر βA بصورت يك پري-پرو-پروتئين با طول 426 آمينواسيد سنتز مي شود كه پس ازحذف بخشهاي پري و پرو، پروتئين بالغ با طول 116 آمينواسيد حاصل مي‌شود. اين پروتئين كه اولين بار از مايع فوليكولي گوسفند بعنوان يك محرك قدرتمند براي توليد هورمون FSH جداسازي شد، داراي عملكردهاي گوناگوني مثل حفظ و بقاي سلول هاي عصبي، آپوپتوز، رشد و تمايز در انسان مي باشد. از آنجاييكه پروتئين اكتيوينA داراي كاربردهاي متعددي در زمينه پزشكي مانند تمايز سلول هاي بنيادي، ترميم زخم، درمان بيماري هاي تحليل عصبي مانند آلزايمر و ...است براي اولينبار در اين تحقيق در سه سويهي متفاوت باكتري E.coli بيان شد. از آنجاييكه پروتئين مذكور در ساختار فعال و عملكردي خود داراي پيوندهاي ديسولفيدي است، محيط احيا كنندهي سيتوپلاسم E.coli براي بيان آن مناسب نمي‌باشد لذا، محيط اكسيد كننده‌ي پريپلاسم جهت توليد آن همراه با تاخوردگي صحيح مورد توجه قرار گرفت. در اين تحقيق، cDNA ژن اكتيوين A انساني بدست آمده از بانك اطلاعاتي NCBI پس از بهينه‌سازي رمزه به همراه پپتيد نشانه تغييريافته آنزيم آلفا آميلاز باكتري باسيلوس ليكني فورميس بومي ‌ايران در وكتور بياني pET21b(+)، ساب كون و سپس به روش ترنسفورماسيون به سويه‌هاي BL21(DE3)pLysS ،BL21(DE3)Rosetta gami و BL21(DE3) انتقال يافت. پس از بيان همزمان با استفاده از القاگر IPTG ، محتواي پروتئيني استخراج شده از هر سه سويه با استفاده از تكنيكهاي SDS-PAGE ، دات بلات و وسترن بلات با يكديگر مقايسه گرديد. نتايج نشان دهنده بيان در هر سه سويه باكتريايي بويژه در Rosetta gamiو DE3 مي باشد.

Human activin A is a homodimer of βA subunit which is synthesized in the form of prepro-activin with 426 amino acids; mature activin A with 116 amino acids is processed from this larger precursor protein. This protein which was extracted for the first time from follicular fluid is a strong stimulator of FSH biosynthesis. The functions have been found to be exerted by activin, including roles in cell proliferation, differentiation, apoptosis and survival of neurons. As this protein plays a considerable role in the treatment of neurodegenerative disease such as Alzheimer,s disease and wound repair, in this study for the first time was expressed in three different strains of E.coli. Activin A has disulfide bonds in its native and functional structure, so the cytoplasmic reducing environment of E.coli is not appropriate for its expression. Therefore, the oxidative space of periplasm for production of correctly folded activin A was considered. In this study, h-activin A cDNA and modified Iranian Bacillus Licheniformis α-amylase signal peptide obtained from NCBI data bank after codon optimization was cloned in pET21b(+) vector and transformed to BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)Rosetta gami and BL21(DE3) strains of E.coli. Expression occurred via induction of promoter with IPTG. Consequently, extracted proteins from these three strains were compared with each other using SDS-PAGE, Dot blot and western blot techniques. The data shows activin A expression especially in BL21(DE3) and BL21(DE3)Rosetta gami strains of E.coli.