تثبيت آنزيم اندوگلوكاناز AaCel9A برروي ماكروبيدهاي كيتوزاني

Immobilization of AaCel9a endoglucanase on chitosan macrobeads

سلولاز آنزيمي پركاربرد در صنايع مختلف مي باشد. تثبيت سلولاز يكي از روش‌هاي پايدارسازي آن است كه نه تنها امكان جداسازي آنزيم از واكنش، بلكه امكان استفاده مجدد از آن را فراهم مي‌سازد و در نتيجه هزينه استفاده آنزيم در صنعت به طور قابل توجهي كاهش مي‌يابد. استفاده از كيتوزان به عنوان بستر جهت تثبيت آنزيم و استفاده گسترده آن در فرآيند‌هاي صنعتي همواره مورد توجه بوده است. ويژگي‌هاي فوق العاده از جمله زيست سازگاري، زيست تخريب پذيري و غير سمي بودن آن، كيتوزان را بستري مناسب جهت فرآيند تثبيت معرفي مي‌كند. در اين مطالعه توالي ژني كد كننده آنزيم اندوگلوكاناز AaCel9A در وكتور بياني pET28a(+) همسانه سازي شد. نتايج حاصل از تعيين توالي مؤيد قرارگيري صحيح قالب ژني AaCel9A در وكتور بود. سپس وكتور حاوي ژن به سلول هاي مستعد اشريشيا كلي سويه BL21 منتقل شده و بيان پروتئين در آن ها القا شد. بيان آنزيم با استفاده از روش الكتروفورز SDS-PAGE و سنجش فعاليت آنزيم تاييد و با ستون نيكل آگارز تخليص بعمل آمد. ساخت ماكروبيدهاي كيتوزان با روش ژله اي شدن صورت گرفت. مولكولهاي آنزيم با استفاده از لينكرهاي گلوتارآلدئيدي به صورت كووالان به بستر متصل و تاييد تثبيت آنزيم توسط FTIR و نيز سنجش فعاليت آنزيمي از ماكروبيدهاي حاوي آنزيم انجام پذيرفت. آناليز نتايج نشان داد كه بهترين شرايط براي تثبيت كوالان آنزيم بر روي بستر در غلظت گلوتارآلدئيد 7/0% و بافر سديم فسفات (7 pH) مي باشد. همچنين آناليز برادفورد و سنجش فعاليت آنزيمي مؤيد تثبيت 85% از مولكول‌هاي آنزيم برروي بستر بود.

Cellulase enzyme has shown their potential application in different industry. cellulase immobilization is one of the different methods for enzymatic stabilization. An advantage of immobilization is enzymatic reusability, which have an economical advantage for enzyme using in industry. Properties of Chitosan as a support for enzyme immobilization are always considerable. Due to its unique biological properties such as biocompability, biodegradability and non-toxicity, chitosan is an attractive support for immobilization. In this investigation Aa-cel9A endoglucanase gene was cloned in pET28 (+) expression vector. Sequencing result had been proved gene cloning in vector. Then the constructed vector was transformed to Eshershia.Coli (BL21) cells and enzyme production was induced. The result obtained from SDS-PAGE analysis and enzymatic assay showed the recombinant protein has been expressed and protein purification was done with Ni-NTA column. Chitosan macrobeads were prepared by precipitation procedure. After immobilization of enzyme with glutaraldehyde as linker, enzyme immobilization has been proved with FTIR and Bradford analysis. The obtained result showed optimum condition for covalent immobization on support are 0.7% of glutaraldehyde concentration and sodium phosphate buffer with pH 7. Bradford analysis and enzymatic activity assay have proved 85% of enzyme molecules immobilized on support.