جداسازي و شناسايي مولكولي باكتري‌هاي تجزيه كننده هيدروكربن‌هاي نفتي از خاك پالايشگاه تبريز

Isolation and molecular identification of hydrocarbondegrading bacteria from soil around Tabriz refinery

سابقه و هدف: طيف گسترده‌اي از مواد آلي شيميايي عمداً يا سهواً وارد محيط زيست مي‌شوند كه نگراني‌هاي عمومي را پديد مي‌آورند. هيدروكربن‌هاي نفتي از شايع‌ترين آلاينده‌هاي زيست‌محيطي هستند كه نشت‌شان به اكوسيستم‌‌هاي دريايي و خشكي به‌عنوان يك خطر بزرگ مطرح است. هم اكنون براي بازسازي مكان‌هاي آلوده، به فناوري‌هاي باصرفه اقتصادي نياز است. يكي از روش‌هايي كه در دهه‌هاي اخير مورد توجه قرار گرفته زيست‌پالايي است. در اين روش از ميكروارگانيسم‌ها و گياهان براي رفع، حذف يا تثبيت مواد آلاينده استفاده مي‌شود. روش بيولوژيك نسبت به روش‌هاي فيزيكي و شيميايي از نظر اقتصادي مقرون به صرفه‌تر است. اين بررسي براي شناسايي و تعيين بهترين باكتري تجزيه‌كننده مواد هيدروكربن نفتي در خاك پالايشگاه تبريز انجام شد. مواد و روش­ ها: در اين بررسي خاك‌هاي آلوده به مواد نفتي از پالايشگاه تبريز جمع‌آوري و براي شناسايي و جداسازي باكتري‌هاي تجزيه‌كننده نفت خام از محيط سنتزي پايه نمكي بوشنل هاس (BHMS) استفاده شد. پس از مرحله غني‌سازي، از محيط كشت جداسازي و خالص‌سازي شدند. از بين سويه‌هايي كه در محيط كشت حاوي نفت خام رشد بيشتري داشتند، دو سويه براي شناسايي انتخاب شد. شناسايي مقدماتي سويه‌هاي جداشده بر اساس رنگ‌آميزي گرم، هوازي يا بي‌هوازي بودن، شكل كلوني و ويژگي‌هاي ميكروسكوپي انجام گرفت. سويه‌هاي انتخاب‌شده به روش مولكولي با استخراج DNA و توالي‌يابي ژن 16S rRNA شناسايي شدند. ميزان رشد باكتري‌ها در ديزل سبك، ديزل سنگين با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر در طول موج 560 نانومتر قرائت شد. براي بررسي توليد بيورسورفكتانت از آزمون‌هاي گسترش نفت خام، انهدام قطره، فعاليت آميزندگي و سنجش آب‌گريزي سطح سلولي استفاده شد. نتايج و بحث: مقايسه توالي به‌دست‌آمده با توالي‌هاي نوكلئوتيدي موجود در بانك‌هاي اطلاعاتي Ribosomal ,NCBI Database Project و Eztaxon نشان داد كه سويه‌هاي موجود با 98 درصد قرابت به باكتري‌هاي spanius Achromobacter و Pseudomonace aeruginosa تعلق داشتند. هر دو باكتري به ترتيب بيشترين رشد را در ديزل سنگين، ديزل سبك و نفت خام نشان دادند. اما باكتري A. spanius در هر سه مواد نفتي نسبت به باكتري P. aeruginosa رشد بيشتري داشت. باكتري A. spanius توانست 67 درصد ديزل سبك را در مدت نه روز تجزيه كند. مثبت بودن آزمون‌هاي گسترش نفت خام و انهدام قطره نشان داد كه باكتري‌هاي شناسايي‌شده مولد بيوسورفكتانت هستند. با توجه به اعداد به‌دست‌آمده، باكتري‌ A. spanius كه بهترين رشد در مواد هيدروكربني را داشت، داراي بالاترين ضريب هيدروفوبيسته سطح سلولي و فعاليت آميزندگي نسبت به باكتري P. aeruginosa نيز بود. نتيجه‌گيري: A. spanius به‌عنوان باكتري كارآمدتر براي تجزيه هر سه مواد نفتي (ديزل سنگين، ديزل سبك و نفت خام) معرفي مي‌شود. با توجه به نتايج حاصل از اين تحقيق، بررسي پتانسيل باكتري‌هاي شناسايي شده در محيط‌هاي آبي و خاك‌هاي آلوده به هيدروكربن‌هاي نفتي براي پاك‌سازي اين آلاينده‌ها توصيه مي‌شود.

Introduction: A wide range of organic chemicals enter into the environment, intentionally or unintentionally, creating public concern. Petroleum hydrocarbons represent one of these organic pollutants threatening various hazards to terrestrial and marine ecosystems. We need cost effective technologies for restoration of contaminated sites, and bioremediation is one the methods which has been used in recent decades. In this method, microrganisms and plants are used to remove, degrade or stabilize pollutants. Biological methods are economically more acceptable than physical and chemical methods. The current study aims to identify the best bacteria for decomposing petroleum hydrocarbons in the soil at Tabriz refinery. Materials and methods: In this study, oil contaminated soils were collected from a refinery in Tabriz and, in order to identify them, a synthetic Bushnell Haas Mineral Salts medium (BHMS) was used. After the enrichment process, separation and purification were performed. Two strains were selected for molecular identification based on the higher growth in a medium containing crude oil. Molecular identification of the selected strains was conducted after DNA extraction and sequencing of the 16S rRNA gene. The growth of bacteria in both light and heavy diesel was recorded using a spectrophotometer at wavelengths of 560 nm. To assess the production of a biosurfactant, several tests including a drop collapsing test, oil displacement test as well as emulsification activity and cell surface hydrophobicity were performed. Results and discussion: The sequences obtained were compared with those of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The isolated bacteria with 98% similarity belonged to Pseudomonas aeruginosa and Achromobacter spanius. Both bacteria showed growth in all the three oil components, however, Achromobacter spanius had higher growth rate compared to Pseudomonas aeruginosa. The latter could decompose 67 percent of light diesel in 9 days. Although both bacteria could produce a biosurfactant, Achromobacter spanius had higher hydrophobic cell surface and emulsification activity. Conclusion: In the current study we introduced Achromobacter spanius as an efficient bacterium for the decomposition of heavy and light diesel and crude oil. Based on the results, it is recomended that the ability of the identified bacteria in petroleum contaminated terrestrial and aquatic environments be investigated further.